ESTUDO DO COMPORTAMENTO E DOS PARÂMETROS FISIOLÓGICOS DE VACAS LEITEIRAS SUBMETIDAS AOS PROCEDIMENTOS DE FISTULAÇÃO E CANULAÇÃO

BEHAVIOR STUDY AND PHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF DAIRY COWS SUBMITTED TO THE PROCEDURES FISTULATION AND CANNULATION

ABSTRACT - Clearly the lack of research and studies that assess the influence of procedures for fistula and cannulation quality of life of the animals of European breeds subjected to high air temperature and high levels of solar radiation, especially when exposed to the field, as in system grazing. Based on this, the present study was conducted in order to assess whether the practices of fistula cannulation and interfere with physiological and behavioral parameters of dairy cows of Holstein. For the experiment, six animals were used, three cannulated and three non-cannulated as a control group, analyzing the behavioral variables related to feed intake, body posture, rumination and searching for shade; respiratory rate (RR) and the surface temperature of the fur (TS) as physiological indicators; and the dry bulb temperature (DBT), mean radiant temperature (MRT), relative humidity (RH) and wind speed (VV) and meteorological variables. The animals, both cannulated and non-cannulated, showed physiological changes (FR = 47 resp / min) and behavioral similar in response to high temperatures, indicating the heat stress condition that they met. The animals have reduced the time spent grazing, increasing therefore the idle time and stayed most of the time (62.13%) in the shade, which may also be indicative of discomfort. The meteorological variables exerted a strong influence on all physiological and behavioral responses (TBS=29,6ºC; UR=47%). Thus, the process of fistula cannulation and does not interfere in animal welfare, when dealing with thermal comfort.

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Introdução

O procedimento de fistulação, que consiste em abrir cirurgicamente um canal entre um órgão e o exterior e, o de canulação que compreende a introdução de uma válvula na cavidade de um dos compartimentos do trato digestório dos animais, são técnicas que possuem grande importância, principalmente nos estudos de nutrição animal, visto que, por meio de tais procedimentos, é possível avaliar a fisiologia e o metabolismo dos pré-estômagos e analisar a saúde do animal mediante a coleta de amostras de material em processo de digestão (Thyfault et al., 1975; Duffield et al., 2004). De acordo com Hungate (1966) e Church (1974), os animais submetidos ao processo adequado de fistulação e canulação apresentam comportamento fisiológico normal, sem incômodo ou dor. Desta forma, não haveria prejuízo no consumo e digestibilidade do alimento, produção de leite, reprodução e longevidade do animal. Oliveira (2010) avaliou os parâmetros fisiológicos e o comportamento ingestivo de novilhos inteiros, fistulados e não fistulados, da raça Sindi, rebanho zebuíno originário dos trópicos paquistaneses que apresenta alta adaptabilidade ao clima semi-árido e excelente capacidade de produção leiteira, verificando que os animais apresentaram respostas fisiológicas e comportamentais semelhantes o que indica a eficiência adaptativa dos animais em uma situação de estresse provocado pelo procedimento cirúrgico de implantação da fístula no rúmen. Entretanto, pouco se sabe sobre o impacto do estresse causado por esses procedimentos sobre a condição de bem-estar dos animais de raças europeias que possuem elevados níveis de produção leiteira, mas são mais susceptíveis ao estresse por calor por possuírem poucas características de resistência a ambientes tropicais caracterizados por alta temperatura do ar e altos níveis de radiação solar, relacionados, intimamente, com a quantidade de calor recebida pelos animais, principalmente quando expostos a campo, como ocorre em sistema de pastejo. O bem-estar animal é um termo que abrange tanto o bem estar físico quanto o mental dos animais, devendo-se considerar os aspectos fisiológicos e comportamentais destes, na tentativa de avaliar sua condição de bem-estar. Assim, surge o conceito das cinco liberdades: liberdade nutricional, liberdade ambiental, liberdade sanitária, liberdade psicológica e liberdade comportamental; desenvolvido pelo Comitê de Bem-Estar de Animais de Produção do Reino Unido (Farm Animal WelfareComitee – FAWC), que compreende um conjunto de princípios essenciais para o bem-estar animal. Desta forma, se faz necessário entender os procedimentos de fistulação e canulação, avaliando se há interferência na qualidade de vida dos animais. Torna-se uma questão de ética averiguar se os animais submetidos a estes procedimentos recebem condições adequadas que satisfaçam suas necessidades básicas e asseguram as cinco liberdades que constituem e garantem o bem-estar animal. A partir dessas informações, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar os parâmetros fisiológicos e comportamentais de vacas leiteiras submetidas aos procedimentos de fistulação e canulação, comparando os resultados com os de animais não fistulados, para verificar a interferência destes na condição de bem-estar desses animais.

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Revisão Bibliográfica

O uso de animais fistulados se tornou uma importante ferramenta para avaliar a saúde do ambiente ruminal, a qual pode ser aferida mediante avaliações das características do seu fluído. Por meio da canulação, é possível avaliar o metabolismo e a fisiologia dos pré-estômagos e analisar a degradabilidade in vitro (Thyfault et al., 1975; Duffield et al., 2004; Muniz et al., 2008), tendo, essa técnica, grande importância nos estudos de nutrição animal. A canulação é usualmente utilizada como alternativa ao uso de sondas, devido estas comprometerem coletas frequentes de líquido por entupirem com facilidade (Muzzi et al., 2009) e não permitirem a obtenção de grande quantidade de material fibroso (Horigane et al., 1989). Para a realização do procedimento, os animais são submetidos a jejum, sedação, antisséptico local, anestesia, incisão e acompanhamento, ou seja, por etapas similares as de uma cirurgia convencional. A introdução da cânula, que pode ser de material rígido ou flexível e ter uma abertura de 8,3 a 11,5 cm de diâmetro, compreende a remoção da pele da área e o afastamento dos músculos no sentido de suas fibras. Todo o procedimento leva mais ou menos uma hora e normalmente é feito de uma única vez, o que reduz o estresse do animal (Muzzi et al., 2009). Algumas complicações podem ocorrer após a implantação de cânulas. Dentre elas está o vazamento do conteúdo ruminal, que ao ocorrer em grande quantidade pode levar o animal à desidratação e desnutrição, além de ocasionar lesões na pele, produzindo um odor desagradável e favorecendo o aparecimento de miíases, segundo Grovum (1989). Para os autores é comum ocorrer necroses na borda da ferida cirúrgica devido à compressão dos tecidos exercida pela cânula, mas a ferida geralmente se recupera chegando a total cicatrização em cerca de 30 dias, devendo o local ser higienizado todos os dias para evitar infecções (Muzzi et al., 2009). Os animais submetidos ao processo adequado de fistulação e canulação apresentam comportamento fisiológico normal, sem incômodo ou dor (Hungate, 1966; Church, 1974). Oliveira (2010), ao avaliar os parâmetros fisiológicos e o comportamento ingestivo de oito novilhos inteiros, fistulados e não fistulados, da raça Sindi, verificou que os animais apresentaram respostas fisiológicas e comportamentais semelhantes. Não houve diferença entre os grupos de animais em relação ao lado escolhido para deitar, sugerindo que a presença da fístula não influenciou a posição que esses animais permaneciam em ócio o que indica a eficiência adaptativa desses animais em uma situação de estresse provocado pelo procedimento cirúrgico de implantação da fístula no rúmen. Mas cada espécie animal apresenta padrões básicos de comportamento que lhes permitem ajustar-se às alterações internas e externas, de acordo com suas necessidades (Hafez, 1969). Alterando seus parâmetros de comportamento ingestivo com o intuito de regular o seu nível de consumo de acordo com suas exigências nutricionais, os ruminantes, por exemplo, adaptam-se às diversas condições de alimentação, manejo e ambiente. No Brasil, a maior parte dos bovinos destinados à produção de carne e leite são criados à pasto, recebendo influência direta do ambiente. O país está localizado em uma região intertropical, onde o calor é predominante na maior parte do ano e na maior parte do território nacional, obrigando os animais a reduzirem o consumo de alimentos para se adequarem ao ambiente, declinando, consequentemente, a sua produção resultando em baixo desempenho dos animais (Armstrong et al., 1993). Por serem animais homeotérmicos, os bovinos apresentam uma maior demanda energética quando há um aumento excessivo em sua temperatura, para que o calor do corpo seja dissipado por meios sensíveis e latentes: condução, convecção, radiação ou evaporação (Mader et al., 1999). Um animal sofrerá estresse calórico quando produzir mais calor do que pode dissipar (Filho et al., 2002). Buscando evitar um acúmulo adicional de calor corporal, o animal promove alterações em seu comportamento, referentes à mudança de postura, movimentação e ingestão de alimentos, reduzindo a produção ou promovendo a perda de calor. Comumente, verifica-se que, vacas leiteiras passam menos tempo pastejando durante o verão, optando por comer em ambientes sombreados e permanecendo maior tempo na posição em pé, a fim de dissipar calor (Pires et al., 1998; Werneck, 2001). Em contrapartida, no inverno, as vacas preferem ficar deitadas e ruminando, permanecendo menor tempo em ócio (Pires, 1997; Pires et al., 1999; Werneck, 2001). Produtores de leite têm se preocupado em reduzir os efeitos nocivos das variáveis climáticas de países tropicais e subtropicais, caracterizados por alta temperatura do ar e altos níveis de radiação solar, em razão da alta incidência de estresse calórico oriundo da baixa adaptação, de raças bovinas leiteiras especializadas e selecionadas em regiões temperadas, às condições de clima e de manejo.

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Materiais e Métodos

O experimento foi realizado no Setor de Bovinocultura de Leite da Fazenda Experimental de Iguatemi (FEI) pertencente à Universidade Estadual de Maringá (UEM). Foram utilizadas seis vacas leiteiras da raça Holandês, com peso médio de 591,17 kg, sendo três vacas não fistuladas como grupo controle, e três vacas que passaram pelos procedimentos de fistulação e canulação ruminal. Os animais foram previamente identificados por meio de fitas de cetim coloridas presas a seus colares de identificação para facilitar a observação e coleta dos dados. As vacas encontravam-se em período seco, para garantir que os dados coletados não sofressem interferência da fase de produção e da alimentação, que difere a cada período de lactação. Optou-se por utilizar animais que apresentassem coloração do pelame semelhante em razão da diferença na troca térmica por radiação entre animais de pelame escuro e claro (Silva, 1999; Pocay et al., 2001). O piquete de experimentação possuía aproximadamente 1,5 hectares, apresentando sombreamento natural composto por árvores das espécies Cedrela fissilis (Cedro) e Peltophorum dubium (Canafístula). As vacas foram transferidas a esse piquete por um período de 48 horas antes do início das coletas para que as mesmas se habituassem ao ambiente. O período experimental teve duração de 12 dias, durante os meses de Agosto a Setembro de 2015, sendo as observações e medições feitas diariamente durante as horas mais quentes do dia, entre as 11:00 e as 14:00 horas, para correlacionar com as horas em que ocorre maior incidência de radiação solar. Um etograma de trabalho foi elaborado para analisar as variáveis comportamentais relacionadas à alimentação (ingestão de água e alimentos), ruminação, postura corporal (em pé ou deitada) e procura por sombra, por meio do método de amostragem por escaneamento em intervalos regulares de 10 minutos durante o período de 3 horas. Já os indicadores fisiológicos, frequência respiratória (FR, resp/min.) e temperatura de superfície do pelame (TS, ºC), foram mensurados a cada 30 minutos durante o período de 3 horas. A FR foi medida pela contagem do número de movimentos respiratórios no flanco das vacas durante um período de um minuto. Para isso, contou-se com o auxílio de um contador manual. A temperatura de superfície do pelame foi determinada por meio de um termômetro de infravermelho (Cole Parmer Instruments, modelo 39650-20). As medidas foram tomadas a aproximadamente um metro de distância do animal. Como variáveis meteorológicas, foram mensuradas em intervalos regulares de 30 minutos durante o período de 3 horas, a temperatura de bulbo seco (TBS, ºC), a temperatura do globo negro (Tgn, ºC), umidade relativa do ar (UR, %) e velocidade do vento (VV, m/s). A TBS e a UR foram medidas por meio de um termo-higrômetro digital (Incoterm, modelo 7663) que foi protegido contra a radiação, porém sem impedir a circulação do ar ao redor do mesmo. A leitura da temperatura foi efetuada assim que o termômetro estabilizou-se no local da avaliação. Para mensurar a Tgn, foram utilizados dois globos negros de Vernon (esfera de cobre, oca, pintada de preto fosco e com 15cm de diâmetro) colocados à mesma altura do solo que o centro do tronco do animal, a cerca de 1,70 metros do solo, sendo um posicionado ao sol e o outro à sombra. Determinou-se a VV com um termo-anemômetro digital (Incoterm, modelo TAN 100). A partir da temperatura do globo negro, calculou-se a temperatura radiante média (TRM, K), conforme descrito por Silva e Maia (2013):

T_RM=[h_G(T_G – T_A)+ ε_GσT⁴_G/ε_Gσ] ^¼, K.

Onde G = 0,95 é a emissividade do globo negro; TG (K) é a temperatura do globo negro; TA (K) é a temperatura do ar; = 5,67051x10-8 W m^-2; K^-4 é a constante de Steffan-Boltzmann e hG (W m^-2 K^-1) é o coeficiente de convecção do globo negro. Também foi calculado a Carga Térmica Radiante (CTR, W m^-2), que é uma importante medida para a comparação entre os ambientes de sol e sombra avaliados. A CTR é calculada por:

CTR = TRM⁴, W m^-2

Os dados meteorológicos e das variáveis fisiológicas foram analisados pelo método dos quadrados mínimos (Harvey, 1960) usando o Statistical Analysis System (SAS Institute, 2000). Os modelos utilizados foram, respectivamente:

Y_ijk = µ + D_i + H_j + e_ij

Onde Y_ijk é a k-ésima observação das variáveis meteorológicas (temperatura do ar, umidade relativa, temperatura radiante média); D é o efeito aleatório do i-ésimo dia de observação (i=1,…,12); H é o efeito fixo do j-ésimo horário de observação (j=intervalos de 30 minutos, entre as 11:00h e as 14:00h); e_ijkl é o resíduo incluindo o erro aleatório e μ é a média paramétrica.

Y_ijklm = µ + D_i + H_j + V_k (G_l) + e_ijkl

Onde Y_ijklm é a m-ésima observação das variáveis fisiológicas (temperatura superficial e frequência respiratória das vacas de leite); D é o efeito aleatório do i-ésimo dia de observação (i=1,…,12); H é o efeito fixo do j-ésimo horário de observação (j=intervalos de 30 minutos, entre as 11:00h e as 14:00h); V é o efeito fixo da k-ésima vaca dentro do l-ésimo grupo (k=1,2,3; l=fistuladas, sem fistula); e_ijkl é o resíduo incluindo o erro aleatório e μ é a média paramétrica. Os dados do comportamento dos animais foram analisados por análise de frequência, utilizando o Statistical Analysis System (SAS Institute, 2000).

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Resultados e Discussão

Durante o período experimental, as médias da temperatura de bulbo seco foram superiores a 26 ºC (Figura 1), que é considerado o limite crítico para a ocorrência de estresse calórico em vacas da raça Holandês (Berman et al.,1985). Para Silva (2000) a zona de conforto térmico para vacas holandesas está entre 5ºC e 21ºC. Temperaturas superiores a essas fazem com que os animais procurem maneiras de dissipar o calor excedente, reduzindo o consumo de alimentos e permanecendo em ócio e, elevando a frequência respiratória e a temperatura corporal. Ao longo da coleta de dados, obteve-se valores médios de umidade relativa que não superaram os 66%, enquanto que a velocidade do vento ficou entre 1,4 e 2,9 m/s (Figura 1). Ambientes com umidade relativa que não supere os 70% e que apresentem vento com velocidade entre 1,9 a 2,5 m/s, facilitam a perda de calor por sudação (Takahashi et al., 2009). As maiores médias de velocidade do vento observadas são favoráveis, pois contribuem para a troca de calor por convecção, amenizando a sensação de calor imposta pelas altas temperaturas. A temperatura radiante média representa as condições de conforto do animal, pois considera todas as fontes de radiação ao seu redor, podendo, desta forma, quantificar os efeitos ambientais que interferem diretamente em seu desempenho produtivo, (Takahashi et al., 2009; Silva, 2000). A partir deste índice, é possível calcular a carga térmica radiante que está proporcionalmente relacionada à temperatura radiante média, ou seja, quanto maior a TRM maior a CTR (Figura 1). A carga térmica radiante está intimamente ligada às trocas térmicas por radiação entre animal e ambiente. Segundo Silva (2008), em ambientes tropicais os valores de CTR desejáveis deveriam ser os menores possíveis, porém, os valores obtidos neste experimento foram altos indicando que os animais estão expostos à alta incidência de radiação (Figura 1), principalmente os valores mensurados ao sol, o que consequentemente justifica a procura de sombreamento pelas vacas. Em ambientes com calor excessivo, os animais procuram a sombra de árvores, abrigos e até de outros animais, pois, a sombra pode reduzir em até 30% a carga de calor radiante sobre o animal (Takahashi et al., 2009). Menores índices de CTR à sombra (Figura 1) explicam a maior frequência na procura por sombra apresentada nesse trabalho (Figura 2). Dentre os processos fisiológicos de termorregulação dos bovinos, em ambientes quentes, os mecanismos de transferência de calor latentes se tornam as principais vias de perda de calor, caracterizados pela evaporação na superfície cutânea e respiratória, sendo esta determinada pelo aumento da frequência respiratória. (Silva, 2000). A temperatura ambiente seguida pela umidade relativa, radiação solar e velocidade do vento, representam as principais influências meteorológicas sobre as variáveis fisiológicas: frequência respiratória e temperatura superficial (Lee et al., 1974). O aumento da temperatura corporal e da frequência respiratória que, em ambiente de conforto térmico, é de 40 resp/min, são os principais sintomas do estresse calórico em vacas leiteiras (Takahashi et al., 2009). Os gráficos da FR e TS apresentaram curva semelhante, indicando uma relação entre o aumento da TS e as elevações da FR (Figura 3). Isso sugere que os animais absorveram calor do ambiente, ocasionando um aumento da temperatura superficial, ativando os mecanismos de termorregulação e causando aumentos na FR. O significativo aumento da FR dentro do estresse calórico é responsável pela dissipação do excesso de calor corporal através da vaporização da umidade no ar respirado. Como modificações comportamentais do animal em resposta as altas temperaturas, tem-se a redução no tempo gasto com o pastejo com consequente aumento no tempo de ócio (Figura 4). Os animais submetidos ao estresse térmico evitam comer e passam a procurar a sombra, permanecendo em ócio na tentativa de diminuir a produção de calor proveniente da fermentação ruminal, porque, quanto mais calor ele produz, maior será o esforço para dissipar o calor excedente para o ambiente. Os animais, independentemente de serem do grupo controle (não fistuladas) ou fistuladas, permaneceram a maior parte do tempo em pé (86,84%), o que também pode ser um indicativo de desconforto (Figura 5). As Figuras 2, 3, 4 e 5 demonstram as respostas fisiológicas e as mudanças comportamentais apresentadas pelos animais diante às altas temperaturas observadas durante o período experimental. As médias expostas evidenciam que os animais se encontravam em situação de desconforto térmico, sendo esta condição compartilhada entre os animais fistulados e sem fístula, visto que as médias apresentadas se assemelharam entre eles. Desta forma, não é coerente dizer que o processo de fistulação e canulação interfere no bem-estar dos animais, quando tratamos de conforto térmico, uma vez que os animais fistulados mobilizaram os mesmos recursos de termorregulação em resposta ao estresse calórico sofrido por eles durante o período experimental, que os animais que não possuíam fístula. Portanto, com relação ao conforto térmico, as vacas fistuladas ou não fistuladas podem alterar suas variáveis fisiológicas quando mantidas em locais com alta incidência de radiação e elevadas temperaturas, o que acarreta em alterações comportamentais, como maior parte do tempo em pé e em ócio. O impacto do desconforto também é observado pela maior procura por sombra, o que nos indica que a manutenção destes animais em pastagem necessita de recursos de sombreamento. Soma-se a isso, os cuidados que devem ser oferecidos aos animais fistulados, a fim de não ferir as cinco liberdades do bem estar animal.

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Conclusões

Os valores médios das variáveis fisiológicas e comportamentais apresentadas nesse trabalho sugerem que os animais se encontravam em condição de estresse calórico. Essa condição foi compartilhada pelos animais fistulados e sem fístula, que mobilizaram os mesmos recursos de termorregulação, em resposta ao estresse calórico sofrido por eles durante o período experimental. Desta forma o processo de fistulação e canulação não interfere no bem-estar dos animais, quando tratamos de conforto térmico.

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Gráficos e Tabelas

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Referências

ARMSTRONG, D. V.; WELCHERT, W. T.; WIERSMA, F. Environmental modification for dairy cattle housing in arid climates: livestock environment. Saint Joseph: American Society of Agricultural Engineers, 1993.   BERMAN, A.; FOLMAN, Y.; KAIM, M.; MAMEN, M.; HERZ, M.; WOLFENSON, D.; ARIELI, A.; GRABER, Y. Upper critical temperatures and forced ventilation effects for high-yeld dairy cows in a subtropical climate. Journal of Dairy Science, v. 68, n. 6, p. 1489-2432, 1985.   CHURCH, D. C. Fisiologia digestiva y nutrición de los ruminantes. Zaragoza: Ed. Acribia, v. 1, 379p, 1974.   DUFFIELD, T.; PLAIZIER, J. C.; FAIRFIELD, A.; BAGG, R.; VESSIE, G.; DICK, P.; WILSON, J.; ARAMINI, J.; MCBRIDE, B. Comparison of techniques for measurement of rumen pH in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 87, n. 1, p. 59-66, 2004.   FAWC: Farm Animal Welfare Committee. Disponível em: <https://www.gov.uk/government/groups/farm-animal-welfare-committee-fawc>.  Acesso em: 13 de Maio de 2015.   FILHO, K. E.; EDUARDO, S. C.; VALÉRIA, P. B. E. Boas Práticas na Produção de Bovinos de Corte. (Embrapa Gado de Corte: Comunicado técnico, 129). Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, 25p, 2002.   GROVUM, W. L. An improved rumen cannulation technique to minimize leakage. Acta Veterinaria Scandinavica - Supplementum, Londres, v. 86, p. 225-228, 1989.   HAFEZ, E. S. E. The behavior of domestic animals. Bailliere, Tindal and Cassell, London, p. 438-481, 1969.   HARVEY, W. R. Least squares analysis of data with unequal subclasse numbers. Beltsville: ARV-USDA, n. 20, p.8, 1960.   HORIGANE, A.; GOCHOU, S.; KISHI, F.; OHTOMO, Y.; HORIGUSHI, M. Silicone rumen cannula with a soft cylindrical part and a hard flange. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 72, n. 12, p. 3230-3232, 1989.   HUNGATE, R. E. The rumen and its microbes. New York: Academic Press, 533p, 1966.   LEE, J. A.; ROUSSEL, J. D.; BEATTY, J. F. Effect of temperature season on bovine adrenal cortical function, blood cell profile, and milk production. Journal of Dairy Science, Cambridge, v. 59, n. 1, p. 104-108, 1974.   MADER, T. L.; DAHLQUIST, J. M.; HAHN, G. L.; GAUGHAN, J. B. Shade and wind barrier effects on summertime feedlot cattle performance. Journal of Animal Science, Champaign, v. 77, p. 2065-2072, 1999.   MUNIZ, J. A.; SAVIAN, T. V.; SCALON, J. D. Parameters estimation in the model for in situ degradability of mertens and loften. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 32, n. 5, p. 1622-1628, 2008.   MUZZI, L. A. L.; MUZZI, R. A. L.; GABELLINI, E. L. A. Técnica de fistulação e canulação do rúmen em bovinos e ovinos. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 33, [s.n], p. 2059-2064, 2009.   OLIVEIRA, P. T. L. UNIVASF, Campus Ciências. Aspectos fisiológicos e comportamentais de novilhos da raça Sindi, fistulados e não-fistulados, alimentados com dietas contendo teores crescentes de feno de erva-sal no Semiárido pernambucano. Tese (Doutorado). Universidade Federal do Vale do São Francisco, 2010.   PIRES, M. F. A. Comportamento, parâmetros fisiológicos e reprodutivos de fêmeas da raça Holandesa confinadas em free stall, durante o verão e inverno. Tese (Doutorado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1997.   PIRES, M. F. A.; VILELA, D.; VERNEQUE, R. S.; TEODORO, R. L. Reflexos do estresse térmico no comportamento de vacas em lactação. In: SIMPÓSIO BRASILEIRO DE AMBIÊNCIA NA PRODUÇÃO DE LEITE, 1., 1999. Piracicaba. Anais... Piracicaba: [s.n.], p. 68-99, 1998.   PIRES, M. F. A.; FERREIRA, A. M. Estresse calórico em bovinos de leite. Cadernos Técnicos de Medicina Veterinária e Zootecnia, [s.i.], n. 29, p. 23-37, 1999.   POCAY, P. L.B.; POCAY, V. G.; STARLING, J.M.C.; SILVA, R. G. Respostas fisiológicas de vacas Holandesas predominantemente brancas e predominantemente negras sob radiação solar direta. Ars Veterinaria, v. 17, n. 2, p. 155-161, 2001.   SAS: Statistical Analysis System. Version 8. Cary, North Carolina: SAS Institute, 2000.   SILVA, R.G. Estimativa do balanço térmico por radiação em vacas Holandesas expostas ao sol e à sombra em ambiente tropical. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 28, n. 6, p. 1403-1411, 1999.   SILVA, R.G. Introdução à bioclimatologia animal. São Paulo: Nobel, 286p, 2000.   SILVA, R.G. Biofísica Ambiental: os animais e seu ambiente. FUNESP,  Jaboticabal, 393p, 2008.   SILVA, R.G.; MAIA, A.S.C. Principles of animal biometeorology. New York: Springer, 2013.   TAKAHASHI, L. S.; BILLER, J. D.; TAKAHASHI, K. M. Bioclimatologia Zootécnica. UNESP, Jaboticabal, 2009.   THYFAULT, H. A.; LEFFEL, E. C.; HUANG, M. D. Simplified method for producing permanent ruminal fistula. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 58, n. 12, p. 1899-1901, 1975.   WERNECK, C. L. Comportamento alimentar e consumo de vacas em lactação (Holandês-Zebu) em pastagem de capim elefante (Pennisetum purpureum, Sehum). Dissertação (Mestrado). Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2001.