Efeito da Quercetina Sobre a Morfologia de Oócitos Caprinos Maturados In Vitro
Luana Barbosa Freire de Figueiredo1, Ana Arlete de Amorim Silva2, Maria Naiara Pereira da Silva3, Joedson Dantas Gonçalves4, Matheus de Jesus Sá Silva5, Laisa Gomes Medeiros Ribeiro6, Mabel Freitas Cordeiro7, Edilson Soares Lopes Júnior8
1 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
2 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
3 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
4 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
5 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
6 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
7 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
8 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
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RESUMO -
Para avaliar o efeito da substituição de cisteamina por quercitina na maturação de oócitos caprinos, ovários foram obtidos em abatedouro. Os oócitos foram colhidos com bomba de vácuo. Os complexos cúmulos oócitos (CCOs) de melhor qualidade foram divididos em 3 grupos: Grupo CIS (controle), os CCOs foram imersos em meio composto de TCM-199 com suplementos incluindo cisteamina; já nos grupos Q4 e Q8, os CCOs foram imersos no meio CIS, mas sem cisteamina e com 4 μM ou 8 μM de quercetina, respectivamente. Os dados percentuais foram comparados com o Qui-quadrado. As médias foram comparadas utilizando o teste de Student Newman Keuls (P < 0,05). O percentual de expansão de células do cumulus foi similar entre os grupos CIS e Q4 e, significativamente, superior ao tratamento Q8. Foi observado mais retração oocitária nos oócitos do grupo Q8. Concluiu-se que 4 µM de quercetina pode ser utilizado em substituição à cisteamina na maturação in vitro de oócitos caprinos.
Palavras-chave: cabra, flavonóide, MIV, óvulo, reprodução
Effect of Quercetin on Morphology of Goat Oocytes Matured In Vitro
ABSTRACT - To evaluate the effect of cysteamine replacement by quercetin on goat oocyte maturation, ovaries were obtained from slaughterhouse. A vacuum pump was used to collect the oocytes. The best cumulus oocyte complexes (COCs) were divided into 3 groups: CIS group (control), COCs were immersed in TCM-199 compound medium with supplements including cysteamine; In Groups Q4 and Q8, the COCs were immersed in the CIS medium, but without cysteamine and with 4 μM or 8 μM of quercetin, respectively. Data expressed as percentage were compared with Chi-Square test. Means were compared using Student Newman Keuls test (P < 0,05). The percentage of cumulus cell expansion was similar between the CIS and Q4 groups and significantly higher than the Q8 treatment. Oocytes from Q8 group present more oocyte retraction. It was concluded that 4 μM quercetin can be used in place of cysteamine in the in vitro maturation of goat oocytes.Keywords: flavonoid, goat, IVM, ova, reproduction
Introdução
A produção in vitro de embriões (PIV) consiste em produzir embriões fora do organismo animal, através dos processos sequenciais de colheita e avaliação de oócitos, maturação e fecundação in vitro de oócitos (MIV e FIV, respectivamente) e cultivo in vitro de embriões. Certamente, tais etapas têm influência no sucesso do resultado final, que é a produção de blastocistos viáveis. Porém, a MIV tem papel fundamental, pois bons resultados na maturação oocitária incrementam os índices de produção embrionária. Diversos meios de maturação oocitária têm sido testados, na tentativa de obter os resultados esperados, mas processos oxidativos inerentes ao processo de MIV tem impedido as altas taxas de produção embrionária. Suplementar os meios de maturação oocitária com substâncias antioxidantes parece ser o caminho para aperfeiçoar a MIV de oócitos, sobretudo na espécie caprina, na qual a PIV tem se tornado um grande desafio. Entretanto, na literatura, não há relatos sobre o efeito da inclusão de quercetina na MIV de oócitos caprinos, principalmente com relação à morfologia de oócitos maturados na presença desse flavonóide. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de duas concentrações (4 µM e 8 µM) de quercetina como antioxidante alternativo à cisteamina na maturação in vitro de oócitos caprinos, especificamente com relação à morfologia oocitária.Revisão Bibliográfica
As taxas de maturação oocitária em condições in vitro são inferiores quando comparadas àquelas in vivo. Um possível fator que justifica essa realidade é a produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (EROs) na maturação in vitro (MIV) de oócitos (SILVA et al., 2010), o que pode culminar com o bloqueio ou retardo do desenvolvimento oocitário, afetando, negativamente, a viabilidade destas células (KANG et al., 2013). Neste sentido, faz-se necessária a otimização da MIV, através da adição de substâncias alternativas com potencial antioxidante associado a um baixo custo de aquisição. A quercetina (3, 5, 7, 3’-4’-pentahidroxiflavona) é um flavonoide natural, largamente encontrado em vegetais, grãos, frutas, flores, chás, possuindo propriedades terapêuticas e potencial antioxidante biológico (BEHLING et al., 2004). O efeito positivo da quercetina já foi observado na maturação oocitária em bovinos (GUEMRA et al., 2013) e suínos (ORLOVSCHI; MICLEA; ZAHAN, 2014). Um aspecto morfológico muito importante para a produção in vitro de embriões é a expansão das células do cumulus após a maturação oocitária. Este importante sinal de maturação é essencial para a eficiência do processo de fecundação in vitro de oócitos.Materiais e Métodos
Ovários caprinos (n = 88) foram obtidos em abatedouro e transportados até o laboratório, conforme Souza-Fabjan et al. (2016). Os ovários foram lavados, três vezes, em solução salina aquecida e, posteriormente, acondicionados em banho-maria, a 30ºC. Para a colheita dos oócitos, foi utilizada uma bomba de vácuo, a uma pressão de 6 a 8 mL/min e agulha 18G. Logo após a colheita, os complexos cumulus oócitos (CCOs) foram homogeneamente divididos em três grupos de maturação: no Grupo CIS (controle), os CCOs foram imersos em TCM-199, suplementado com EGF (10 µL/mL), FSH/LH (10 µL/mL), soro de ovelha em estro (100 µL/mL) e cisteamina (10 µL/mL); já nos Grupos Q4 e Q8, os CCOs foram imersos no meio controle, porém sem cisteamina e com 4 μM ou 8 μM de quercetina, respectivamente. Os CCOs (n = 50) foram dispostos em placas de cinco poços de 500 µL de meio MIV, sob óleo mineral, durante 24 horas, em estufa de cultivo, a 38,5ºC, em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Para a avaliação da presença de retração oocitária, ou seja, se a membrana plasmática estava distante da zona pelúcida do oócito, além da da expansão das células do cumulus, os oócitos maturados foram avaliados sob estereomicroscópio, segundo a metodologia de Avelar et al. (2012). O grau de expansão das células do cumulus foi classificado como: Total (Grau 1), Moderado (Grau 2) e Leve (Grau 3), conforme a metodologia de Aghaz et al. (2015). Os oócitos foram incubados em gotas de 50 μL, contendo 5 μL/mL de Hoechst 33342 em PBS 10 mM, durante 15 minutos, a temperatura ambiente, no escuro e lâminas foram preparadas para leitura em microscópio de epifluorescência, com uma ampliação de 400x. Os oócitos foram submetidos a avaliação de cromatina, onde verificou-se aqueles oócitos em metáfase II, ou seja, maduros. Os dados percentuais foram comparados, utilizando o teste do Qui-quadrado. As médias foram comparadas pelo teste de Student Newman Keuls. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05.Resultados e Discussão
O percentual de expansão de células do cumulus foi similar entre os grupos CIS (controle) e Q4 e, significativamente, superior ao tratamento Q8 (Tabela 1; P<0,05). Após 24 h do início da maturação, a taxa de retração oocitária em meio contendo 8 µM de quercetina foi superior (P<0,001) aos demais tratamentos (Tabela 1). No tocante aos graus de expansão das células do cumulus, o tratamento contendo 8 µM de quercetina apresentou menor proporção de oócitos expandidos com Grau 1 (Total), comparado aos tratamentos controle e com 4 µM de quercetina e, ao mesmo tempo, maior proporção de oócitos expandidos com Grau 3 (Leve) (P<0,05) (Tabela 2). Com relação à taxa de maturação nuclear, o percentual de oócitos que alcançaram o estágio de metáfase II foi maior (P<0,05) nos oócitos maturados em meio suplementado com 4 µM de quercetina (57,1%), quando comparados aos oócitos maturados no tratamento CIS (25%), não havendo diferença significativa para tal parâmetro entre os grupos CIS (25%) e Q8 (47%). Os meios de MIV suplementados com 4 µM de quercetina (Q4) ou 100 µM de cisteamina (CIS) apresentaram taxas similares de expansão de células do cumulus e retração oocitária (não promoveram danos celulares). Nossos resultados são semelhantes aos encontrados por Orlovschi, Miclea e Zahan (2014), que observaram excelentes taxas de expansão de células do cumulus em oócitos suínos maturados em meio contendo 25 µg/mL de quercetina. Estes resultados sugerem que a suplementação com quercetina ou cisteamina, nas concentrações supracitadas, pode influenciar o processo de mucificação da célula oocitária, bem como sua qualidade. Por outro lado, a suplementação de 8 µM de quercetina ao meio de MIV resultou numa menor taxa de expansão de células do cumulus e maior percentual de retração oocitária, quando comparado aos demais tratamentos. Uma possível razão para este fenômeno é que a estrutura molecular deste flavonoide é semelhante à estrutura de estrógenos e pode, possivelmente, interagir com seus receptores, atuando como um fitoestrógeno. Dessa forma, na concentração testada, a quercetina modularia a atividade oocitária (ORLOVSCHI; MICLEA; ZAHAN, 2014), resultando na redução de síntese e liberação de secreção de 17β-estradiol (E2) e na da síntese de fatores de crescimento pelas células da granulosa (SANTINI et al., 2009), influenciando, assim, o ambiente celular e, consequentemente, reduzindo o potencial de expansão das células do cumulus, uma vez que o E2 possui um importante papel para a mucificação das células intrafoliculares (KUBO; ILSE; MIYANO, 2015). Em nosso estudo, observamos um maior percentual de oócitos que atingiram metáfase II no grupo Q4, quando comparados àqueles maturados no grupo controle (CIS). Esses achados diferem dos observados por Guemra et al. (2013), que não verificaram diferenças significativas após MIV de oócitos bovinos em meio com cisteamina e/ou quercetina.Conclusões
Em conclusão, 4 µM de quercetina pode ser utilizado em substituição à cisteamina na maturação de oócitos caprinos. Todavia, 8 µM de quercetina é prejudicial à morfologia de oócitos caprinos maturados in vitro.Gráficos e Tabelas
