Efeito do colesterol carregado pela ciclodextrina sobre a motilidade espermática de garanhão da raça Nordestina
Elenice Andrade Moraes1, Wildelfrancys Lima de Souza2, Ricardo Toniolli3, James K Graham5
1 - Universidade Federal do Vale do São Francisco
2 - Universidade Estadual do Ceará
3 - Universidade Estadual do Ceará
5 - Colorado State University
2 - Universidade Estadual do Ceará
3 - Universidade Estadual do Ceará
5 - Colorado State University
RESUMO -
Objetivou-se avaliar o efeito da adição de colesterol no sêmen de garanhões da raça Nordestina sobre a motilidade espermática. Vinte ejaculados de dois garanhões foram diluídos com BotuSemen e colesterol carreado pela ciclodextrina (CCC) adicionado no sêmen: controle, 0,75 mg de CCC e 1,0 mg de CCC/120×106 sptz/mL, e incubado a 26°C/15min. O sêmen foi diluído 1:5 (v/v) com diluente Lactose-gema de ovo e resfriado a 5°C/2h, envasado em palhetas de 0,5 mL, e acondicionado sob vapor de nitrogênio líquido, e depois imersos. As amostras foram descongeladas (37°C/30s) e avaliadas. As variáveis foram analisadas pela ANOVA e teste de Tukey (P<0,05). A motilidade total e progressiva foi (P<0,05) maior no sêmen tratado com CCC comparado ao controle. Adição de colesterol no sêmen de garanhão Nordestino melhora o percentual de motilidade espermática após a criopreservação.
Palavras-chave: Espermatozoide, Equus caballus, motilidade, Equus caballus, motilidade
Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on motility of stallion sperm of the Nordestina breed
ABSTRACT - The objective was evaluate the effect of adding cholesterol in the semen of Nordestina stallion breed on sperm motility. Twenty semen samples were used from two stallions, diluted with BotuSemen diluent and cholesterol add as follows: control, 0.75 mg of CCC and 1.0 mg of CCC/120x106 sperm/mL, and incubated for 15 min at 22°C. The samples were diluted 1:5 with lactose-yolk egg diluent and cooled to 5°C over a two hours, packaged into 0.5 mL straws and frozen in static liquid nitrogen vapor before being plunged into nitrogne. Samples were thawed (37°C/30s) and analyzed. The variables were analyzed by ANOVA and means compare by Tukey test (P<0.05). Higher percentages of total and progressive motile was higher for sperm treated with CCC compared to control. Addition of cholesterol in the semen of Nordestina breed improve the percentage of sperm motility after cryopreservation.Keywords: Spermatozoa, Equus caballus, motility
Introdução
Os espermatozoides de alguns equinos apresentam tamanha sensibilidade a baixas temperaturas, que somente é possível utilizar o sêmen no estado fresco, situação na qual são reduzidos os benefícios gerados pela inseminação artificial para um considerável número de reprodutores (AURICH, 2008). No entanto, pesquisas tem demonstrado que a incorporação do colesterol na membrana espermática, protege a célula espermática durante o resfriamento, além de reduzir os danos celulares decorrentes da criopreservação (MORAES et al., 2015; SOUZA et al., 2016). Adicionalmente, o colesterol também promove à estabilização e modulação da fluidez da membrana a temperatura corpórea (LEE et al., 2015; YILDIZ et al., 2015). Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da adição de colesterol no sêmen de garanhões da raça Nordestina sobre a motilidade espermática.Revisão Bibliográfica
A raça Nordestina se caracteriza, principalmente, pela rusticidade, sobriedade, rigidez muscular, porte pequeno e bem proporcionado, cascos duros que dispensam o uso de ferraduras, temperamento sociável e amistoso, fácil adaptação ao meio e ao processo de criação (ARAÚJO, 1983). Utilizada, principalmente, na lida com o gado é uma raça moldada pela aridez e deficiências da região Nordeste do Brasil, pois pode viver com pouco alimento, de modo grosseiro e bebendo pouca água. A despeito destas condições e de sua pequena estatura, magreza e aparência resignada, trabalha bem viajando grandes distâncias (ENCICLOPÉDIA, SD). É, portanto, insubstituível em seu ambiente natural, a caatinga agressiva, onde presta relevantes serviços à economia da região, não só transportando cargas, como também pessoas. Para este fim a inseminação artificial (IA) é a biotécnica reprodutiva de eleição, pois propicia a seleção de reprodutores de alto valor genético e o ganho genético (ALMEIDA, 2006). Associada à criopreservação do sêmen, a IA representa uma importante ferramenta na preservação da raça equina, tanto pela maximização do uso de reprodutores superiores como pela formação de um banco genético disponível por tempo indeterminado (SAMPER; HANKINS, 2001). Entretanto, variações quanto a certos aspectos do sêmen congelado/descongelado, descritas em várias raças equinas (ALVARENGA et al., 2003), é um entrave a disseminação da técnica e têm inclusive levado à classificação dos garanhões como “resfriadores bons” ou “resfriadores ruins” segundo a susceptibilidade do ejaculado à criopreservação (BRINSKO et al., 2000; BATELLIER et al., 2001; CARMO; ALMEIDA, 2006). A ausência de seleção genética para características de fertilidade e resistência espermática à congelação como de fatores biofísicos e bioquímicos característicos dos espermatozoides parecem ser os responsáveis pelos insucessos observados na espécie equina (SAMPER; HANKINS, 2001; VARNER, 2003; LOOMIS; GRAHAM, 2008).Materiais e Métodos
Aspectos Éticos O presente estudo foi realizado após a aprovação institucional da Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf), sob o protocolo nº 0006/161012. Local de execução O experimento foi realizado no Centro de Pesquisa em Suínos, Espécies Nativas e Silvestre (CPSENS), localizados no Campus de Ciências Agrárias da Univasf, situados no munícipio de Petrolina-PE. Preparo do colesterol O colesterol carregado com ciclodextrina foi preparado como descrito por Moraes et al. (2010). Brevemente, 200 mg de colesterol foram dissolvidos em 1 mL de clorofórmio e 1 g de metil-β-ciclodextrina dissolvido em 2 mL de metanol. Em seguida, alíquota de 0,45 mL da solução de colesterol foi adicionada à solução de ciclodextrina e agitada até a combinação das soluções ficarem clara. A solução resultante foi colocada em placa de petri de vidro para remoção dos solventes, por meio do fluxo de gás de nitrogênio com pureza mínima de 90%. Logo após, os cristais resultantes foram colocados para secar em placa aquecedora por 24 horas, e decorrido este tempo, foram estocados em tubos de vidro a 22 °C. A solução de trabalho de colesterol carregado com ciclodextrina (CCC) foi preparada pela adição de 50 mg de CCC em 1 mL do TALP a 37 °C e homogeneizada por agitação com auxílio do agitador de tubos. Animais Foram utilizados dois garanhões da raça Nordestina, com idade média de 9,5 anos, selecionados através de exame andrológico. Os garanhões foram mantidos em baias individuais, sendo clinicamente sadios e provenientes da Fazenda da Associação Brasileira de Criadores do Cavalo Nordestino, localizada em Juazeiro, BA (09°25’00” de latitude S; 40°30’00” de longitude O). Coleta e processamento do sêmen Após 72h do esgotamento dos garanhões, iniciou-se a coleta do sêmen para análise, realizando-se duas coletas por semana para cada garanhão (n=20). Após cada coleta, o ejaculado foi filtrado com auxílio do filtro de nylon e o volume determinado por visualização direta em Tubo Falcon graduado. Logo após, foi realizada a diluição do sêmen (1:1) com diluidor de transporte (BotuSêmen®, Biotech), e o ejaculado foi transportado em uma caixa térmica para o CPSENS, mantido em banho-maria a 35 °C, No CPSENS, a concentração espermática foi determinada utilizando um fotômetro (Spermacue®, Minitub). Então, o sêmen foi homogeneizado e submetido à centrifugação em tubos cônicos (50 mL) a 400 g por 7 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e os peletes resultantes da centrifugação foram ressuspendidos no diluidor de congelação (BotuCrio®, Biotech), pré-aquecido a 35 °C, para a concentração de 120 x 106 sptz/mL e avaliados quanto às motilidades total (MT) e progressiva (MP) utilizando o sistema de análise computadorizada (CASA®, Minitub, Berlin, Alemanha). Ejaculados com menos 70% de MT foram descartados. Para determinação dos tratamentos experimentais, o CCC foi adicionado ao sêmen diluído, estabelecendo os tratamentos: controle (sem adição do CCC), 0,75 mg de CCC e 1,0 mg de CCC/120 x 106 sptz/mL. Logo após, as amostra foram retiradas do banho maria e mantidas a 22 °C, por 15 min, para iniciar a curva de congelação. Após esse período, o sêmen foi diluído 1:5 (v/v) com diluente Lactose-Gema de ovo e acondicionadas em câmara fria a 5 °C por duas horas. Depois, as amostras de cada tratamento foram envasadas em palhetas de 0,5 mL e lacradas com seladora (UltraSeal®, Minitub) e acondicionadas sob vapores do nitrogênio liquido, por 10 minutos (-60 °C/min). Decorrido este tempo, as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido (-196 °C) e estocadas em botijão criogênico para posterior análise. A descongelação foi realizada mergulhando-se as palhetas com as amostras de sêmen no descongelador automático por 30 segundos a 37 °C. Duas palhetas de cada tratamento foram descongeladas conforme descrito acima para avaliação da motilidade espermática (total e progressiva), utilizando o CASA. O conteúdo de cada palheta foi diluído 1:8 (v:v) com o diluente BotuSêmen®, para concentração final de 50 x 106 sptz/mL e cada uma das amostras mantidas a temperatura ambiente por 5 min antes da serem analisadas. Alíquotas de 8 μL de cada amostra por tratamento foram analisadas, individualmente, sobre lâmina pré-aquecidas, a 37 °C. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando-se o programa SAS 9.2 2002-2008 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.Resultados e Discussão
O efeito do colesterol carreado com ciclodextrina sobre a motilidade espermática após a congelação/descongelação dos espermatozoides de garanhão são apresentados na Figura 1. A porcentagem de motilidade total e progressiva dos espermatozoides de garanhão foram maiores nas amostras tratadas com 0,75 mg de CCC, quando comparado ao trato com 1,0 mg de CCC e o grupo controle (Figura 1; P<0,05).Conclusões
Os efeitos protetores da adição do colesterol carreado com ciclodextrina sobre os espermatozoides do garanhão Nordestino são particularmente eficazes, melhorando o percentual de motilidade espermática após a criopreservação.Gráficos e Tabelas
