AFERIÇÃO DA METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA BRUTA

STANDARDIZATION OF THE METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF CRUDE PROTEIN

ABSTRACT - Objective to evaluate the methodology for the determination of crude protein. Were tested two sample weights and different number of repetitions. Evaluated ground corn, hay of Tifton and soybean meal, weights of 300 and 500 mg for the analysis of crude protein, with 2 and 4 repetitions for each sample with different weight. The data were subjected to statistical analysis, through the F-test and Student-Newman-Kells. By analyzing the crude protein values of the food it was found that there was no significant effect for any of the variables tested. The sample weight and number of reps, and your interaction, did not influence the results showing that the quantity of 2 g of the sample and use of two repetitions were enough to get the value of protein. It can be concluded that the sample weight of 300 mg and 2 reps, are sufficient for the determination of crude protein in samples of corn, soybeans and hay of tífton 85.

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Introdução

A análise da quantificação de proteína presente nos alimentos é uma importante ferramenta para elaboração e balanceamento das rações para alimentação animal. O Método Kjeldahl para determinação de nitrogênio é considerado o método padrão usado mundialmente e aprovado por associações científicas como a AOAC International e a ISO (MOORE et al., 2010; CHEMAT; HADJ-BOUSSAAD; CHEMAT, 1998). È possível encontrar ampla variação entre metodologias e dentro da mesma metodologia de determinação de proteína quanto ao peso da amostra e tempo de realização preconizados, em função dessa variação, surge a dúvida da possível alteração dos valores encontrados após a análise das amostras devido a diferentes peso da amostra e número de repetições. Com este trabalho, objetivou-se avaliar a metodologia de determinação de proteína bruta descrita por Silva e Queiroz (2006) em amostras de milho moído, farelo de soja e feno de Tifton 85, para isso foi alterado o peso de amostra e número de repetições realizadas durante a análise.

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Revisão Bibliográfica

Os princípios básicos do método Kjeldahl são a digestão com solução ácida e aquecimento, a destilação com adição de uma base e aquecimento e a titulação com solução padrão de ácido clorídrico (SILVA; QUEIROZ, 2006). A finalidade do método é determinar o nitrogênio contido na matéria orgânica e inorgânica, sendo o resultado é expresso em porcentagem de proteína bruta. A finalidade do método é determinar o nitrogênio contido na matéria orgânica e inorgânica, no entanto, é mais indicado e utilizado em amostras de origem biológica. Nesse caso, é determinado tanto o nitrogênio proteico como o não proteico e por isso o resultado é expresso em porcentagem de proteína bruta. Para calcular o teor de proteína bruta multiplica-se a porcentagem encontrada de nitrogênio por um fator de conversão. Esse fator normalmente é adotado como sendo 6,25, pois considera-se que o teor de nitrogênio presente nas proteínas seja, em média, de 16%, desconsiderando a quantidade de nitrogênio não proteico do material que, em suma, é insignificante (LYNCH; BARBANO, 1999; SAHA et al., 2013; ZENEBON; PASCUET; TIGLEA, 2008). Entretanto, cada proteína apresenta uma sequência de aminoácidos e, por consequência, o teor de nitrogênio é diferente variando de 13,4% a 19,3% (SÁEZ-PLAZA et al., 2013) podendo cada grupo de alimento ter o seu fator de conversão. Outros métodos de determinação de proteína encontram-se disponíveis no mercado como alternativa ao Método Kjeldahl, sendo eles o método de Dumas, reagente de Nessler, reação de Biureto, espectrofotometria de refletância no infravermelho proximal (NIRS), espectroscopia em ultravioleta, método de Lowry, método de Bradford e outros (LOPES; SANTANA, 2005; GUIMARÃES, 2003).

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Materiais e Métodos

Os alimentos testados foram milho moído, feno de Tifton 85 e farelo de soja com teor de matéria seca de 88,47%, 86,33% e 89,84%, respectivamente. A metodologia foi adaptada das recomendações de Silva e Queiroz (2006). Foram empregados pesos de 300 e 500 mg, 2 e 4 repetições. As amostras foram acondicionadas em tubos de ensaio com adição de 2,5 g de mistura digestora composta por sulfato de potássio e sulfato de cobre pentaidratado e, em seguida, 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Em bloco digestor, as amostras passaram por uma digestão de aproximadamente 4 horas, com aumento gradativo da temperatura a cada 30 minutos até 350ºC, e ao atingiu a coloração verde-claro, foi mantido por mais 15 minutos. Após a solução alcançar temperatura ambiente, foi adicionado 20 ml de água destilada e, em seguida, feita a destilação por arraste a vapor com 25 ml de hidróxido de sódio a 50% em destilador de nitrogênio modelo SL-74. O produto destilado foi coletado em erlenmeyer contendo 50 ml de água destilada e 50 ml de solução de ácido bórico a 4% + indicador (solução mista de vermelho de metila e verde de bromocresol). O volume do destilado de aproximadamente 100 ml foi titulado com solução padronizada de ácido clorídrico 0,1 N. Em conjunto com as amostras, foi feito um teste em branco para eliminar a interferência e contaminação dos reagentes.   A porcentagem de nitrogênio foi calculada pela fórmula:   Em que: V_HCl = volume de HCl gasto na titulação; V_b = volume de HCl gasto no teste em branco; f = fator de correção do HCl 0,1 N; 14 = equivalente-grama do nitrogênio; P = peso da amostra em mg. Para calcular a porcentagem de proteína bruta, multiplicou-se o valor de nitrogênio pelo fator de conversão 6,25. Os dados foram corrigidos para a matéria seca dos alimentos e submetidos à análise estatística, utilizando-se o programa SAEG (1997), por meio de teste F e de Student-Newman-Kells (SNK) a 5% de probabilidade.

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Resultados e Discussão

Os resultados de proteína bruta observadas nas amostras de milho moído, farelo de soja e Tífton 85 estão descritos na Tabela 1. Ao analisar os valores de proteína bruta dos alimentos milho, farelo de soja e feno verificou-se que não houve efeito significativo para nenhuma das variáveis testadas. O peso da amostra e número de repetições, e sua interação, não influenciaram os resultados encontrados evidenciando que a quantidade de 2 gramas de amostra e uso de duas repetições foram suficientes para obter o valor de proteína presente no alimento. Resultados semelhantes foram obtidos por Galvani e Gaertner (2006) que ao proporem a redução da quantidade de amostra e de reagentes utilizados no método Kjeldahl concluíram que não houve diferença significativa nos valores de proteína bruta de três espécies forrageiras. Diante do resultado observado é possível afirmar que amostras de dois gramas e duas repetições são suficientes para determinar o teor de proteína, que pode ser confirmado pelo baixo coeficiente de variação obtido. A precisão de uma metodologia representa a dispersão de resultados. A precisão pode ser avaliada coeficiente de variação (CV) das medidas obtidas, que utiliza um número significativo de medições, onde o coeficiente de variação não deve ultrapassar 15% (Valentini, 2002). Comparando-se os dados estatísticos de proteína bruta da amostra de milho, farelo de soja e feno de tífton pode-se avaliar a precisão da metodologia. O coeficiente de variação foi baixo, portanto, as alterações no peso da amostra e no número de repetições utilizadas proposta pela metodologia em estudo não influenciaram significativamente nos resultados de proteína bruta. Os parâmetros estatísticos de proteína bruta das espécies forrageiras indicaram um baixo grau de dispersão dos resultados e auxiliaram na confirmação da precisão da metodologia proposta.

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Conclusões

Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que peso de amostra de 300 mg e duas repetições, são suficientes para a determinação de proteína bruta de amostras de milho moído, farelo de soja e feno de tífton 85.

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Gráficos e Tabelas

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Referências

CHEMAT, Z.; HADJ-BOUSSAAD, D. E.; CHEMAT, F. Application of atmospheric pressure microwave digestion to total Kjeldahl nitrogen determination in pharmaceutical, agricultural and food products. Analusis, v. 26, p. 205-209, 1998.   GUIMARÃES, P. C. Estimativa dos teores de fenilalanina em sopas desidratadas instantâneas: importância do nitrogênio de origem não protéica. São Paulo: USP, 2003. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bromatologia) Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003.   LYNCH, J. M.; BARBANO, D. M. Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products. Journal of AOAC International, v. 82, n. 6, p. 1389-1398, 1999.   LOPES, D. C.; SANTANA, M. C. A. Determinação de proteína em alimentos para animais: métodos químicos e físicos. Viçosa: UFV, 2005.   MOORE, J. C. et al. Total protein methods and their potential utility to reduce the risk of food protein adulteration. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v. 9, n. 4, p. 330-357, 2010.   SÁEZ-PLAZA, P. et al. An overview of the Kjeldahl Method of nitrogen determination. Part I. Early history, chemistry of the procedure, and titrimetric finish. Critical Reviews in Analytical Chemistry, v. 43, n. 4, p. 178-223, 2013.   SAHA, U. et al. Common terms used in animal feeding and nutrition. University of Georgia Cooperative Extension Bulletin 1367, 2013.   SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. 3. ed. Viçosa: UFV, 2006.   VALENTINI, S. A. Atributos da validação da metodologia analítica do Captopril num programa de garantia de qualidade. 75p. 2002. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Produção, Universidade Federal de Santa Catarina, 2002. Acesso em: 22 fev. 2006. Disponível em: http://teses.eps.ufsc.br/defesa/pdf/8241.pdf.   ZENEBON, O.; PASCUET, N. S.; TIGLEA, P. (Coords.). Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008.