AMIDO NA DIETA NÃO CAUSA PREJUÍZO NA IMUNIDADE DE PACUS, Piaractus mesopotamicus: ATIVIDADE DE LISOZIMA COMO INDICADOR DE IMUNIDADE INATA
Basia Schlichting Moromizato1, Carolina Vasconcelos Tavares de Farias2, Luana Camargo Sousa3, Jaqueline Dalbelo Biller - Takahashi4, Celso Tadao Miasaki5
1 - UNESP - Dracena
2 - CAUNESP - Jaboticabal
3 - CAUNESP - Jaboticabal
4 - UNESP - Dracena
5 - UNESP -Dracena
2 - CAUNESP - Jaboticabal
3 - CAUNESP - Jaboticabal
4 - UNESP - Dracena
5 - UNESP -Dracena
RESUMO -
O estudo descreve o método de determinação da atividade da lisozima em pacu alimentados com níveis crescentes de amido na dieta a fim de avaliar a sua resposta imune. O experimento foi conduzido no Laboratório de Aquicultura da UNESP – Campus de Dracena, distribuído em seis tratamentos e quatro repetições (T1: 0,02; T2: 0,10; T3: 0,39; T4: 0,60; T5: 1,40 e T6: 2,45 amilose/amilopectina), sendo os blocos divididos de acordo com a faixa de peso inicial (bloco 1: 23,6 ± 2,8 g e 10,9 ± 0,5 cm; bloco 2: 29,2 ± 3,0 g e 11,3 ± 1,5 cm; bloco 3: 33,6 ± 1,8 g e 12,0 ± 0,5 cm e bloco 4: 41,7 ± 2,6 g e 12,8 ± 0,5 cm). Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo Teste de Tukey (5%). Os valores da lisozima não diferiram significativamente entre os tratamentos. O protocolo se mostrou confiável, sendo apropriado para determinar a atividade da lisozima do soro de pacu nas condições experimentais.
Palavras-chave: Palavras-chave:metodologia; imunidade, carboidratos.
STARCH ON DIET DOES NOT IMPAIR THE IMMUNITY OF PACUS, Piaractus mesopotamicus: LYSOZYME ACTIVIVITY AS AN INNATE IMMUNITY INDICATOR
ABSTRACT - The study describes the method of determining the activity lysozyme in pacu fed with increasing levels of starch in the diet in order to evaluate its immune response. The experiment was conducted at the Aquaculture Laboratory of UNESP - Dracena Campus, distributed in a DIC with six treatments and four replications (T1: 0.02, T2: 0.10, T3: 0.39, T4: 0.60 ; T5: 1.40 and T6: 2.45 amylose / amylopectin), the blocks being divided according to the initial weight range (block 1: 23.6 ± 2.8 g and 10.9 ± 0.5 cm; Block 2: 29.2 ± 3.0 g and 11.3 ± 1.5 cm, block 3: 33.6 ± 1.8 g and 12.0 ± 0.5 cm and block 4: 41.7 ± 2.6 G 12.8 ± 0.5 cm). The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and the means compared by the Tukey test (5%). The lysozyme values did not differ significantly among treatments. The protocol showed a reliable assay,appropriate to determine the serum bactericidal activity of pacu in the present experimental conditions.Keywords: Keywords: methology, immunity, carbohydrates.
Introdução
O crescimento da população mundial, associado com as mudanças nos hábitos alimentares podem trazer como consequência o aumento no consumo do pescado, sabidamente uma excelente fonte de proteína animal. Impulsionando, deste modo, a aquicultura (cultivo de diversos organismos aquáticos, em destaque a piscicultura) como a principal atividade capaz de suprir essa demanda. Estudos publicados pela FAO (2014) corroboram esta afirmação uma vez que a aquicultura será responsável por 62% do abastecimento de peixe no mundo em 2050. Sendo assim, é importante determinar estratégias para minimizar os custos de produção (inlcuindo o alimento a ser utilizado na criação, os impactos ao meio ambiente, diversidade das espécies utilizadas e produto de qualidade) tornam-se fundamentais para o sucesso desta atividade (MELO et al., 2016). O uso de carboidratos na dieta é uma alternativa para minimizar os custos de produção, entretanto há poucos estudos sobre as exigências desse nutriente para as diversas espécies, bem como seus efeitos sobre a saúde de peixes (Hilton et al.,1987). Dessa forma, no presente estudo, avaliamos o efeito das características estruturais do amido sobre a imunidade de juvenis de pacu alimentados com dietas contendo níveis crescentes de amilose e decrescentes de amilopectina. Sendo T1: 0,5/38,7; T2: 6,9/32,6; T3: 10,3/29,5; T4:20,4/18,6; T5: 27,3/11,0/ e T6: 28,4/9,8 % de amilose e % de amilopectina, respectivamente.Revisão Bibliográfica
Diversos alimentos podem ser utilizados para compor uma dieta para peixes. Dentre os alimentos energéticos utilizados em rações para peixes, os mais comuns são o milho, o sorgo e o trigo (RIBEIRO et al., 2012). Os alimentos de origem animal são melhores aproveitados e mais utilizados em dietas de peixes carnívoros. Peixes herbívoros e onívoros conseguem aproveitar de maneira mais eficiente alimentos de origem vegetal (carboidratos solúveis ou não) apresentando uma digestão mais complexa (MELO et al., 2016). Entre as espécies nativas mais estudadas visando sua exploração comercial, destaca-se o pacu com boa aceitação no mercado. Possui elevado valor comercial, adaptação à alimentação artificial e pela facilidade de obtenção de larvas da reprodução induzida (URBINATI, GONÇALVES e TAKAHASHI, 2010). Conhecer melhor os sistemas reguladores do metabolismo, para utilizar dietas ricas em carboidratos como fonte de energia e alta tolerância, são de grande importância para o desenvolvimento de dietas que atendam às exigências sem prejudicar a saúde e o desenvolvimento do animal (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002). Assim, conhecer melhor as relações fisiológicas é importante para diminuição custos e manter a saúde animal. Os peixes também estão susceptíveis a qualquer tipo de invasão parasitária e infecções bacterianas, virais ou fúngicas. Quando o organismo do animal se depara com algum tipo de enfermidade, rapidamente é processada uma resposta de defesa denominada reação imunológica (BALFRY; HIGGS, 2001). O sistema imunológico nos peixes é constituído de elementos inatos e adquiridos, humorais e mediados por células responsáveis por defender o organismo do animal contra qualquer agente invasor evitando diversas formas a instalação de doenças (ELLIS, 2001). Compõem os elementos humorais inatos: as antiproteases, lisozima, proteínas do sistema complemento (ativada pela via alternativa e da lectina). Esta atividade de lisozima foi baseada no método clássico de causar lise uma suspensão de Micrococcus lysodeikticus e medida por meio da redução da densidade óptica verificada durante a lise da parede celular da bactéria (SMOLELIS e HARTSELL, 1949). Essa lisozima tem capacidade de atuar sobre ligações β-1,4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e o ácido N-acetilglicosamínico de membranas de parede celular bacterianas, levando a sua lise e consequente destruição do patógeno (PAULSEN et al., 2003).Materiais e Métodos
Os peixes foram alimentados com seis dietas (T1: 0,5/38,7; T2: 6,9/32,6; T3: 10,3/29,5; T4:20,4/18,6; T5: 27,3/11,0/ e T6: 28,4/9,8 % de amilose e % de amilopectina) com quatro blocos/repetições de acordo com o peso inicial (bloco 1: 23,6 ± 2,8 g e 10,9 ± 0,5 cm; bloco 2: 29,2 ± 3,0 g e 11,3 ± 1,5 cm; bloco 3: 33,6 ± 1,8 g e 12,0 ± 0,5 cm e bloco 4: 41,7 ± 2,6 g e 12,8 ± 0,5 cm) cada, por 90 dias. Foi realizada coleta do sangue em dois peixes por repetição (n=6). A coleta do sangue foi realizada através da punção do vaso caudal para obtenção de soro para determinação da atividade de lisozima. A análise foi realizada por ensaio turbidimético, segundo Parry (1965) com adaptações. A partir da curva padrão determinada com lisozima liofilizada de clara de ovo de galinha, foi quantificada as concentrações de lisozima nas diversas amostras utilizando a equação da reta. Assim, 50 µL soro (em triplicata) foram depositados em microplacas, de acrílico estéril de 96 cavidades, em 50 µL de tampão fosfato de sódio (0,05 M, pH 6,2), após homogeneizados, o soro foi submetido a diluições sucessivas com razão constante igual a 2, mantendo um volume final de 50 µL por cavidade. Em cada cavidade foi depositado 125 µL de suspensão de M. Lysodeikticus (0,2% em tampão fosfato de sódio). A redução da densidade óptica, em 450 nm, foi avaliada entre 0,5 e 5,0 minutos a 30ºC. Os resultados em concentração (µg mL-1 de amostra) foram obtidos a partir da redução da δ DO para cada volume de amostra avaliada, e os resultados em unidade de atividade (U mL-1) foram determinados como a quantidade de enzima que produziu, em 450 nm, um δ DO de 0,001 min-1 (WON et al., 2004). O experimento foi conduzido em DBC com seis tratamentos e quatro blocos (bloco=repetição). Os resultados foram submetidos ao teste de normalidade e homocedasticidade das variâncias. E foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e as médias comparadas pelo Teste de Tukey (5%), pelo programa SAS, v.9.0.(2002).Resultados e Discussão
O sistema imune de peixes possui mecanismos responsáveis para defesa contra bactérias, apresentando componentes inatos e adquiridos, humorais e mediados por células, que atuam de forma multifatorial na tentativa de evitar a colonização bacteriana.Entre os componentes humorais inatos, há os fatores inibidores do crescimento de bactérias, como a transferrina, antiproteases e lisinas (como a lisozima, proteína C reativa, peptídeos antibacterianos e as proteínas do sistema complemento ativadas pela via alternativa, sendo as últimas a mais importante, pois possui atividade lítica, pró inflamatória, quimiotáxica e opsonizante, influenciando a ação de células de defesa) (Ellis, 1999) As lisinas são peptídeos antibacterianos que atacam membranas dos patógenos (Ellis, 2001), por exemplo, a lisozima, enzima que lisa componentes de peptideoglicano da parede de bactérias gram positivas e negativas (Magnadotir, 2006), estão presente no muco, ovos, sangue e tecido onde há leucócitos (principalmente monócitos e neutrófilos) (Murray & Fletcher, 1976). A lisozima tem capacidade de atuar sobre ligações β-1,4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e o ácido N-acetilglicosamínico de membranas de parede celular bacterianas, levando a sua lise e conseqüente destruição do patógeno (PAULSEN et al., 2003). A atividade de lisozima tem sido utilizada para avaliar o estado imunológico de peixes após imunomodulações, uma vez que sistema imune pode ser modulado por diversos fatores, tais como as alterações na dieta (Biller-Takahashi et al, 2014). No presente estudo, não houve alterações na atividade da lisozima entre os tratamentos (Figura 1), indicando que é possível utilizar altos níveis de amido na dieta sem alterar essa variável imunológica. A atividades de lisozima, enzima lítica de grande importância na defesa contra patógenos, pode ser utilizada como indicar de imunidade inata, e no presente estudo dietas com maiores quantidades de amilopectina podem ser utilizadas em pacus, sem prejuízos nessa resposta imunológica.Conclusões
O estudo demonstrou que a inclusão de níveis crescentes de amido na dieta não causou prejuízo imunológico nos juvenis, uma vez que não foram observados comprometimentos na resposta de defesa mediada pela lisozima, que é uma proteina muito importante para a imunidadea de peixes.Gráficos e Tabelas
