Bioatividade in vitro de leguminosas taniníferas sobre a população de Ruminococcus flavefaciens em bovinos de corte

In vitro bioactivity of taniniferous legumes on the population of Ruminococcus flavefaciens in beef cattle

ABSTRACT - The aim of the study was to evaluate the in vitro effect of 10 tannin legumes on the Ruminococcus flavefaciens population in the beef cattle microbiota. Four adult rumen-cannulated Nellore cattle grazing a tropical grass pasture with free access to a mineral premix and fresh water were used as inoculum donors. A bioassay based on the in vitro gas production technique was used to estimate the biological activity of tannins. The experimental design included an entirely randomized blocks with factorial arrangement. The data were subjected to analysis of variance followed by Duncan test to determine the significance of the difference between treatment means. The results showed that the condensed tannins (TC) from L. procumbens species reduce population of R. flavefaciens.

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Introdução

Os taninos são substâncias naturais encontradas em folhas, caules e sementes de algumas plantas consumidas por ruminantes. Ao precipitarem proteínas, os taninos, resultam em efeito antimicrobiano e antifúngico, onde a inibição bacteriana pode ser causada por vários mecanismos, tais como alterações na permeabilização da membrana citoplasmática, inibição de enzimas extracelulares microbianas e ações diretas sobre o metabolismo microbiano (Daglia, 2012).

As propriedades antimicrobianas dos taninos permite com que esse metabólito secundário seja uma alternativa natural à utilização de aditivos químicos na manipulação do ecossistema ruminal (Ribeiro Pereira, 2013). Dentre as bactérias responsáveis pela degradação da fibra no rúmen, Ruminococcus flavefaciens é uma das espécies celulolíticas principais. Dentro desse contexto, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito in vitro de 10 leguminosas taniníferas sobre a população de R. flavefaciens na microbiota de bovinos de corte.

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Revisão Bibliográfica

Vários estudos têm demonstrado que leguminosas temperadas (Hedysarium coronarium, Lespedeza cuneata, Lotus corniculatus e L. uliginosus) e leguminosas tropicais (Calliandra calothyrsus, Flemingia macrophylla), fontes de compostos secundários como os taninos condensados (TC) quando utilizadas em concentrações moderadas como estratégia nutricional, podem alterar beneficamente a microbiota ruminal (Lascano & Cárdenas, 2010; Patra & Saxena, 2011).

Os taninos condensados (TC) são substâncias formadas pela polimerização de unidades de flavonoides, geralmente flavan-3-óis e/ou flavan-3,4-dióis. Esses taninos também são denominados de proantocianidinas (Patra & Saxena, 2011), pois podem ser hidrolisados por ácidos fortes a antocianidinas. Tais polímeros, de elevado peso molecular, são resultado de mecanismos desenvolvidos ao longo da escala do processo evolutivo pelas plantas, como forma de defesa contra a herbivoria (Muir, 2011). Estes componentes têm sido mostrados como capazes de exercer atividades antihelmíntica, antimicrobiana e antioxidante em ruminantes, afetando positivamente o bem-estar animal e a qualidade dos produtos oriundos destes (Patra & Saxena, 2011; Luciano et al., 2011; Fagundes et al., 2014).

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Materiais e Métodos

O experimento foi desenvolvido no laboratório de Fermentabilidade Ruminal do Departamento de Zootecnia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, localizado no município de Pirassununga, São Paulo.

Foram utilizadas dez leguminosas exóticas ricas em TC, sendo Flemingia macrophylla, Leucaena leucocephala, Stylosanthes guianensis, Gliricidia sepium, Cratylia argentea, Cajanus cajan, Desmodium ovalifolium e Macrotiloma axilare de ambiente tropical e Desmodium paniculatum e Lespedeza procumbens de ambiente temperado.

A bioatividade das leguminosas sobre a microbiota de bovinos foi obtida através de bioensaio in vitro (Theodorou et al., 1994; Mauricio et al.,1999). Como doadores de inóculo ruminal foram utilizados quatro bovinos Nelore fistulados, mantidos a pasto com livre acesso a água e sal mineral. Em cada garrafa de vidro de 160 mL foram adicionados em duplicata, 0,5 g de cada planta (tratamento) seca e moída a 1 mm juntamente com 25 mL de inóculo e 50 mL de solução nutritiva. Após 24 h de incubação, amostras do líquido ruminal contido em cada garrafa foram coletadas para a realização das análises de PCR em tempo real (qPCR) segundo protocolo descrito por Denman & McSweeney (2006).

O delineamento experimental utilizado foi em blocos aleatorizados em arranjo fatorial, sendo 24 tratamentos: 12 forrageiras (dez leguminosas e 2 controles) com e sem polietilenoglicol, com 4 repetições (blocos) e duas réplicas dentro de cada bloco.

Para extração de DNA foi utilizado o Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega®). A concentração do DNA obtida de cada amostra foi quantificada utilizando espectrofotômetro. Após a extração e dosagem da concentração de DNA das amostras do rúmen, estes foram submetidos a técnica de qPCR utilizando os respectivos primers: 96F: 5`-CGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGG-3` e 220R: 3-CGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACC-5`.

Os parâmetros avaliados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e o teste de média utilizado foi Duncan ao nível de 5% de probabilidade. Os procedimentos estatísticos foram obtidos com auxílio do programa SAS 9.2.

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Resultados e Discussão

Dentro do grupo sem PEG observou-se maiores valores de R. flavefaciens para C. cajan, M. axilare, S. guianensis, C. argentea e L.leucaena e menores valores para L.procumbens, F. macrophylla, D.ovalifoium e D. paniculatum e G. sepium. Na comparação dentro da interação, apenas L. procumbens apresentou valores significativamente inferiores de R. flavefaciens com relação a adição de PEG.

 No presente estudo, apenas os taninos da espécie L. procumbens resultaram em uma diminuição na população da bactéria R. flavefaciens. A inibição deste microrganismo por algumas leguminosas se deve a reatividade dos taninos presente nessas espécies. A grande variação entre a composição química dos TC nas plantas como também em uma mesma espécie, justiça a ausência de resposta nas demais espécies.  Em corroboração aos resultados, Guimarães-Beelen et al. (2006) observaram que a exposição de culturas de R. flavefaciens a taninos de Mimosa hostilis e de Bauhinia cheilantha inibe drasticamente o crescimento bacteriano, sendo esta população menos afetada pelo teor de tanino da leguminosa Mimosa caesalpinifolia, quando em baixa concentração. Estes mesmos autores verificaram que a concentração de 50 μg/mL do tanino de M. hostilis e de B. cheilantha é suficiente para reduzir o crescimento de R. flavefaciens em 80 e 78%, respectivamente, contra apenas 24 % para o tanino de M. caesalpinifolia.

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Conclusões

       Os resultados mostraram que os TC da espécie L. procumbens causam redução na população de R. flavefaciens, confirmada em presença do PEG. Os estudos moleculares confirmaram a ação dos TC mais reativos sobre a população deste microrganismo. 

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Gráficos e Tabelas

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Referências

DAGLIA, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Current opinion in Biotechnology, v.23, p.174-181, 2012.

FAGUNDES, G. M.; MODESTO, E. C.; FONSECA, C. E. M.; LIMA, H. R. P.; MUIR, J.P. Intake, digestibility and milk yield in goats fed Flemingia macrophylla with or without polyethylene glycol. Small Ruminant Research,v.116, p.88-93, 2014.

LASCANO, C. E.; CÁRDENAS, E. Alternatives for methane emission mitigation in livestock systems. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39 (supl. especial), p.175-182, 2010.

LUCIANO, G.; VASTA, V.; MONAHAN, F.J; LÓPEZ-ANDRÉS, P.; BIONDI, L.; LANZA, M.; PRIOLO, A. Antioxidant status, colour stability and myoglobin resistance to oxidation of longissimus dorsi muscle from lambs fed a tannin-containing diet. Food Chemistry, v.124, p.1036-1042, 2011.

MAURICIO, R.M.; MOULD, F.L.; DHANOA, M.S.; OWEN, E.; CHANNA, K.S.; THEODOROU, M.K. A semi-automated in vitro gas production Ttechnnique for ruminant feedstuff evaluation. Animal Feed Science and Technology, v. 79, p. 321-330, 1999.

MUIR, J. P. The multi-faceted role of condensed tannins in the goat ecosystem. Small Ruminant Research, v. 98, p.115–120, 2011.

PATRA, A. K.; SAXENA, J. Exploitation of dietary tannins to improve rumen metabolism and ruminant nutrition. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.91, p.24-37, 2011.

RIBEIRO PEREIRA, L.G. Métodos de avaliação e estratégias de mitigação de metano entérico em ruminantes. Revista Colombiana de Ciências Pecuárias, v. 26, p. 264-277, 2013.

THEODOROU, M.K.; WILLIAMS, B.A.; DHANOA, M.S.; MCALLAN, A.B.; FRANCE, J. A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds. Animal Feed Science and Technology, v. 48, p. 185-197, 1994.