Conservantes no leite para diagnóstico de gestação bovina por imunoensaio
Geraldo Balieiro Neto1, Luiz Carlos Roma Junior2, Márcia Saladini Vieira Salles3, Enilson Geraldo Ribeiro4, Aníbal Eugênio Vercesi Filho5, Acyr Wanderley de Paula Freitas6
1 - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
2 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
3 - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
4 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
5 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
6 - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
2 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
3 - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
4 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
5 - Instituto de Zootecnia, APTA/SSA
6 - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
RESUMO -
Objetivou-se avaliar conservantes em amostras de leite destinadas ao diagnóstico de prenhes por imunoensaio. Foram coletadas amostras de leite de 10 vacas prenhas e 7 não prenhas. As amostras foram submetidas aos seguintes tratamentos de conservação: bronopol; peróxido de hidrogênio 3% a 4°C; citrato de sódio a 24ºC; citrato de sódio a 4°C; sem conservante a -15oC. Dez dias depois as amostras foram submetidas a análise de prenhes através do teste IDEXX Milk Pregnancy, para a detecção de glicoproteínas associadas a prenhes. Comparando os resultados dos tratamentos com os do bronopol observou-se que o peroxido de hidrogênio a 4°C, citrato de sódio a 4°C e as amostras congeladas foram compatíveis (100%), mas o com citrato de sódio em temperatura ambiente mostrou baixa compatibilidade (64,70%). O peroxido de hidrogênio a 4ºC, citrato de sódio a 4ºC ou o congelamento a -15ºC são eficientes na preservação de leite destinadas ao diagnóstico de prenhes através da detecção de glicoproteínas.
Palavras-chave: eficiência reprodutiva, imunoensaio, teste prenhez
Preservatives in milk for diagnosis of bovine pregnancy by immunoassay
ABSTRACT - The study aims to evaluate preservatives in milk samples to pregnancy analysis by immunoassay. For this, samples were collected in 10 pregnant and 7 nonpregnant cows. The milk samples were submitted to conservation treatments: bronopol; Hydrogen peroxide 3% at 4°C; Sodium citrate at 24°C; Sodium citrate at 4°C; without preservative at -15°C. Ten days after the samples were submitted to pregnancy analysis using the IDEXX Pregnancy Milk Test for detection of pregnancy-associated glycoproteins. Comparing the results of the treatments with those of the bronopol it was observed that the hydrogen peroxide at 4°C, sodium citrate at 4°C and the frozen samples were compatible (100%), but the sodium citrate at room temperature showed low compatibility (64.70%). Hydrogen peroxide at 4°C, sodium citrate at 4°C and the freezing at -15oC are efficient in preserving milk to detection of pregnancy-associated glycoproteins.Keywords: reproductive efficiency, immunoassay, pregnancy test
Introdução
O diagnóstico de gestação é uma ferramenta fundamental de avaliação da eficiência reprodutiva. A precocidade e acurácia do exame permite a identificação de problemas de fertilidade tanto do rebanho, como individuais, e a tomada de decisões evitando que falhas na concepção ou reabsorção embrionária prolonguem o intervalo entre partos reduzindo a eficiência reprodutiva e os índices de produtividade da propriedade. A sincronização visa concentrar os períodos de cio em curto espaço de tempo, e torna-se importante por facilitar o emprego da inseminação artificial, assim com concentrar os períodos de manifestação de cio e de parição, permitindo a formação de lotes homogêneos de animais, em épocas mais adequadas para o produtor, detecção precoce de problemas de fertilidade e a racionalização da mão-de-obra na propriedade. Os métodos tradicionais de diagnóstico de gestação são o controle da manifestação de estro, palpação transretal, ultrassonografia, testes químicos e mais recentemente a detecção de proteínas especificas da prenhez no sangue ou no leite. Os métodos tradicionais possuem limitações como observação constante da manifestação de cio, visitas periódicas de um especialista em reprodução, a habilidade do técnico especialista, o que pode acarretar em falhas no diagnóstico e custos mais elevados ao produtor. A detecção de proteínas da prenhez no leite por imunoensaio é um teste rápido, não invasivo, prático para lotes com grande número de animais e muitas vezes mais preciso que os demais métodos. Contudo, as amostras devem ser preservadas, desde a coleta na fazenda até a análise no laboratório. Atualmente a preservação é feita com o conservante bronopol, que possibilita o transporte de amostras da propriedade até o laboratório, no entanto seu custo encarece a análise. Este trabalho teve como objetivo avaliar o uso de diferentes conservantes e refrigeração sobre a acurácia do diagnóstico de gestação em amostras de leite preservadas por 10 dias, na tentativa de diminuir os custos de análises de prenhez em benefício do produtor rural.Revisão Bibliográfica
O desempenho reprodutivo é muito importante em qualquer sistema de produção leiteira, pois permite que a vaca retorne ao momento em que é mais eficiente em produzir leite, o início da lactação. Assim, uma boa eficiência reprodutiva, caracterizada por curtos intervalos entre partos faz com que a propriedade tenha uma alta taxa de natalidade e elevada porcentagem de vacas em lactação. Isso tem reflexos na produção total de leite por dia do rebanho, além de maior número de crias nascidas por ano (Ferreira, 2010). A biotecnologia na reprodução é, sem dúvida, um dos produtos da pesquisa mais simbólico na área da ciência animal. Deixou uma marca decisiva na evolução da agricultura nos últimos sessenta anos, tanto quanto os consideráveis progressos realizados também durante este período no domínio da alimentação de animais domésticos. A primeira tecnologia gerada na área da reprodução foi a inseminação artificial, seguida da transferência de embrião, depois a sexagem embrionária, inseminação em tempo fixo, clonagem e a mais recente a transgenia (Thibier, 2005). A evolução das técnicas de criação, a introdução de raças mais precoces e especializadas e o uso de biotecnologias da reprodução vêm melhorando os índices de produtividade dos rebanhos bovinos. As biotecnologias envolvem o melhoramento genético e reprodutivo do rebanho, com o uso da inseminação artificial, a transferência de embriões e da fecundação e produção de embriões in vitro e mais recente com o uso da clonagem ou transferência nuclear com células somática (Azevedo et al., 2015). Para que a utilização destas tecnologias de reprodução seja válida há a necessidade de um rápido e preciso diagnóstico de prenhez. A perda de prenhez é comum e gera inúmeros prejuízos econômicos e o quanto antes houver este diagnóstico mais rápido pode ser a ação do técnico ou do produtor em introduzir este animal novamente para emprenhar e ou sua mudança para lotes de animais prenhes. A detecção da prenhez tem evoluído ao longo das últimas décadas e a importância da detecção precoce da gravidez é fundamental para minimizar a quantidade de tempo que uma vaca gasta não prenhe (Reese et al.,2016). A falha na gravidez é extremamente cara para o produtor, e o teste de prenhez é utilizado como uma ferramenta de aprimoramento em programas reprodutivos, e a detecção precoce de vacas prenhas podem ser realizadas aos 28 ou 45 dias de gestão. Segundo Vasconcelos e Garcia (2006), o diagnóstico da gestação por ultrassonografia aos 28 dias após a inseminação é importante para identificar as vacas prenhes precocemente e propiciar a reinseminação das vacas vazias, reduzir o intervalo entre as inseminações e consequentemente o intervalo do parto à concepção. Existem diversos métodos para o diagnóstico da gestação, como a observação constante de cio, a palpação transretal, a ultrassonografia, os testes químicos e os métodos mais atuais de detecção de proteínas especificas da prenhez obtidas no sangue ou no leite. Como relatado acima os métodos tradicionais possuem limitações porque demandam de manejos constantes de visualização de cio, a necessidade de visitas periódicas de técnicos para o diagnóstico de prenhez dos animais, aumento do número em que os animais têm que ser manejados, ocasionando custos mais elevados e prejuízos ao bem estar dos animais. Por outro lado o leite para o teste de detecção proteínas especificas da prenhez pode ser realizado durante o manejo de ordenha, evitando perdas na produção de leite, menos manejo dos animais, menor estresse, otimização da mão de obra da propriedade e a identificação de vacas vazias com maior rapidez e eficiência, aumentando a eficiência do manejo reprodutivo, propiciando a redução dos custos com o manejo reprodutivo e perdas financeiras.Materiais e Métodos
Para a realização dos testes de prenhez no leite foi realizada a coleta de leite de 17 vacas da raça Holandesa, sendo 10 vacas com média de estágio de gestação de 142 dias e diagnóstico de prenhez confirmada e 7 vacas vazias oriundas da fazenda experimental do Instituto de Zootecnia, situado na cidade de Nova Odessa, SP. As amostras de leite (40 mL) foram coletadas na ordenha da manhã e em seguida divididas em sub-amostras de 2 mL e acondicionadas tubos estéreis de acordo com os seguintes tratamentos de conservação: bronopol (BRP); peróxido de hidrogênio 3% em refrigeração a 4°C; citrato de sódio e mantidas em temperatura ambiente (24°C); citrato de sódio e mantidas em refrigeração (4°C); congeladas (-15oC). Para a obtenção da solução de peróxido de hidrogênio 3% foi utilizado água oxigenada 10 volumes. Os tratamentos com citrato de sódio foram conduzidos em tubo BD Vaccutainer Seditainer com solução de Citrato de Sódio tamponado 0,105 mol/L (3,2%), capacidade 3,6 mL. Todos os tratamentos seguiram o mesmo protocolo de homogeneização da amostra com o respectivo conservante. As amostras foram acondicionadas de acordo com os tratamentos e temperaturas pelo período de 10 dias, para só então ser realizado o teste de detecção de prenhez. O teste de detecção de prenhez foi realizado no Laboratório de Imunoensaio Aplicado à Produção Animal e Segurança Alimentar do Polo Regional Centro Leste, situado na Fazenda Experimental da APTA, Ribeirão Preto, SP. Foi realizada análise de imunoensaio enzimático para a detecção de glicoproteínas associadas à prenhez (PAGs) através do kit ELISA IDEXX Milk Pregnancy Test (06-41209-03). O teste consiste em um ensaio em placa de microtitulação recobertas com anticorpos anti-PAG. Após a incubação da amostra ser testada na cavidade impregnada, a PAG capturada é detectada juntamente com o anticorpo específico da PAG por uma solução detectora e um conjugado de peroxidase de raiz forte (conjugado HRPO). Na próxima etapa, o conjugado que não se ligou é lavado e o substrato tetrametilbenzina (TMB) é acrescentado às cavidades. Ocorre o desenvolvimento da coloração que é proporcional à quantidade de PAG na amostra. O aparelho utilizado foi um EZ Read Microplate Readers, sendo as leituras realizadas com absorbância de 450 e 650 nm, de acordo com a recomendação do kit IDEXX. Para a interpretação de leitura das amostras adotou-se o critério de valor preconizado pelo teste, onde os valores de absorbância ≥ 0,250 foram considerados prenhes (SIM) e < 0,100 não prenhes (NÃO).Resultados e Discussão
O Milk Pregnancy Test da IDEXX teve 100% de acerto em relação ao diagnóstico realizado com ultrassom, sendo portanto, plenamente confiável. Os resultados dos testes de prenhez do tratamento com bronopol foram considerados como referência para a comparação dos demais tratamentos com diferentes métodos de conservação, por se tratar do reagente recomendado para a conservação de amostras de leite descrito no manual. Quando comparamos os tratamentos com os encontrados pelo bronopol observou-se que os tratamentos de peróxido de hidrogênio a 4°C, citrato de sódio a 4°C e as amostras de leite sem conservante e congeladas foram integralmente compatíveis com os resultados do conservante padrão bronopol. As amostras de leite conservadas com citrato de sódio em temperatura ambiente mostraram baixa compatibilidade de resultados (64,70%) com as do bronopol, o que pode comprometer a acurácia dos resultados de diagnósticos de prenhez. Tendo em vista que os conservantes utilizados nas amostras de leite preservaram as mesmas por 10 dias, simulando com boa margem o período entre a coleta do leite na propriedade e o início das análises no laboratório, pode-se dizer que os resultados encontrados tornam essa importante ferramenta de diagnóstico de prenhes mais acessível e menos dispendiosa àqueles produtores que desenvolvem suas atividades mais distante dos laboratórios disponíveis.Conclusões
O peroxido de hidrogênio a 4ºC, citrato de sódio a 4ºC ou o congelamento a -15ºC são eficientes em preservar amostras de leite destinadas ao diagnóstico de prenhes por imunodetecção de glicoproteínas.Gráficos e Tabelas
