EFICIÊNCIA DA INVERSÃO SEXUAL DE TILÁPIAS RECEBENDO NIVEIS CRESCENTE DE HORMÔNIO 17- α-METILTESTOSTERONA

EFFICIENCY OF SEXUAL INVERSION OF TILÁPIAS WITH GROWTH OF HORMONE 17-α-METHYLTESTOSTERONE

ABSTRACT - The objective of this study was to evaluate the efficiency of the sexual inversion in batches of tilapia (Oreochromis nilóticus) treated with different doses of the hormone 17-α-methyltestosterone in the diet, through the histological analysis of the gonads of the animals and to describe the external factors that may interfere In the production process. Firstly, the entire inversion process was done, from breeding selection to larval feeding, with balanced feed, adding 45, 60 and 75 milligrams of 17-α-methyltestosterone / kg of feed for 28 days. After this period, the animals were transferred to different tanks, where they remained for 60 days, when some specimens of each treatment were randomly collected. After being weighed and counted, they were sacrificed in 10% formalin solution for later histological analysis of the gonads, using a solution of carmine acetate and observing the presence or not of oocytes. The histological analysis of the gonads revealed a 96.25% inversion rate for the treatment with 45 mg of the hormone / kg of feed, 98.27% for the treatment with 60 mg and 100% for treatment with 75 mg, It can be inferred numerically that the higher the hormone dosage, the higher the rate of inversion. Despite the low ambient temperature observed and consequently the low water temperature in the experimental tanks, the three levels of the hormone studied were highly effective in promoting sexual inversion in tilapias (efficiency above 95%). However, the performance of the animals was impaired, being below that found for species at 90 days.

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Introdução

O Brasil é um dos países com grande potencial para expansão da aquicultura. Segundo Madrid (1998), a aquicultura brasileira apresentou, entre os anos de 1995 e 1996, o significativo crescimento de 30% em sua produção, sendo este aumento consideravelmente superior ao da produção mundial, notando-se que as produções asiáticas já estão em seu limite máximo de produção, demonstrando sinais de deficiência em água e solo. A tilapicultura é uma das principais atividades aquícolas do País, sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais. Dentre as vantagens que o Brasil apresenta para o desenvolvimento da tilapicultura, destacam-se o clima favorável, a grande produção de grãos para a fabricação de rações e também a presença de grandes mananciais hídricos que favorecem a prática da piscicultura (YASUI, 2006). Segundo Tachibana (2002), a tilápia do Nilo é a espécie mais produzida no Brasil, devido à sua rusticidade e rápido crescimento. O seu hábito alimentar é planctófago, podendo facilmente aceitar ração comercial; a sua carne é considerada de ótima qualidade, sem espinhos e com um rendimento de filé de aproximadamente 33%. Entretanto, o cultivo intensivo de tilápia do Nilo apresenta como maiores entraves a capacidade de reprodução em água parada e o fato de a maturidade sexual ocorrer antes de atingir o peso comercial, já que a maioria das espécies de tilápias alcança a sua maturidade sexual muito cedo, geralmente entre o 4° ou 6° mês de vida (KUBITZA, 1997). A solução para este problema foi encontrada no cultivo de peixes monossexo (95 -100% de machos), que consiste em cultivar apenas indivíduos machos para engorda, impedindo a reprodução nos tanques e proporcionando maior rendimento em crescimento de indivíduos machos. Na tilápia do Nilo, os machos apresentam melhor crescimento e desempenho na engorda, uma vez que as fêmeas, além de utilizarem grande parte de suas reservas para as atividades reprodutivas, não se alimentam durante o período da incubação oral dos ovos (PHELPS; POPMA, 2000). Várias são as opções para se conseguir populações monossexo, incluindo métodos genéticos, não genéticos e até mesmo uma combinação entre eles. Dentre os principais métodos utilizados, destacam-se a sexagem manual, a hibridação interespecífica, a manipulação cromossômica e a inversão hormonal (BORGES, 2004). A técnica mais utilizada comercialmente para a obtenção de lotes monossexuais masculinos de tilápias é a inversão sexual, que consiste em induzir o sexo fenotípico através de hormônios, já que, nos primeiros estágios de desenvolvimento, as tilápias não apresentam o sexo fenotípico definido (YASUI, 2006). O hormônio mais utilizado neste processo, provavelmente devido ao seu potencial androgênico, baixo custo e facilidade de ser excretado após o tratamento, é o andrógeno sintético 17α- metiltestosterona (PHELPS; POPMA, 2000).   Os objetivos do presente trabalho foram obter lotes monossexos masculinos de tilápias Oreochromis niloticus através da inversão sexual com o hormônio masculinizante 17 α-metiltestosterona no outono, medir a eficiência dessa inversão através da análise de gônadas dos alevinos e avaliar os fatores externos que podem interferir na produção e engorda dos peixes.

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Revisão Bibliográfica

Reprodução da espécie   A tilápia do Nilo apresenta atributos que a torna uma das melhores espécies de peixe para a aquicultura, principalmente nos países em desenvolvimento: rápido crescimento, tolerância à ampla faixa de condições ambientais (temperatura, salinidade, baixo oxigênio dissolvido), resistência a estresse e doenças, habilidade de reprodução em cativeiro, baixo intervalo entre gerações, alimentação no mais baixo nível trófico e aceitação de alimentos artificiais imediatamente após a absorção do saco vitelino (EL-SAYED, 2006). Ela é típica de ambiente tropical, adaptando-se melhor em clima onde a temperatura varie entre l8 ºC e 28 ºC. Temperaturas abaixo de 12 ºC e acima de 42 ºC são letais. A desova é estimulada entre 22 ºC e 24 ºC (LUND; FIGUEIRA, l989). Segundo Castagnolli (1992), o melhor desempenho da tilápia é obtido com a temperatura da água entre 26 °C e 28 °C e, quando esta é inferior a 15 °C, pouco se alimenta e não se reproduz. De acordo com seu comportamento reprodutivo, Popma & Lovshin (1996) dividiram as tilápias em três grupos taxonômicos: Tilápia spp, animais que incubam seus ovos em substratos; Oreochromis spp, grupo no qual as fêmeas incubam os ovos dentro da cavidade bucal; e Sorotherodon spp, grupo em que machos ou ambos os sexos incubam os ovos na boca. No gênero Oreochromis, o macho é responsável pela escavação do substrato (ninho), e a fêmea por coletar os ovos na boca e realizar a incubação oral, no intuito de oxigenação dos ovos e defesa da prole contra possíveis predadores (YASUI et al. 2006). Proença e Bittencourt (1994) colocam que o fator mais limitante para o cultivo das tilápias é a sua alta capacidade de se reproduzir em cativeiro. Animais com peso em torno de 50 gramas podem iniciar sua vida reprodutiva, desviando elementos plásticos (proteínas) e energéticos (lipídios e carboidratos) para a reprodução, em detrimento do crescimento. Desovam naturalmente em temperaturas superiores a 20 °C, a cada 50 ou 60 dias. De acordo com o seu tamanho, cada fêmea pode gerar de 100 a 500 alevinos, prejudicando a produção final por competição por alimento e oxigênio, além de consequente heterogeneidade da população. Estes fatores tornam esta estratégia de produção inaceitável comercialmente, agravada ainda pelo fato de que, ao final, o peso das fêmeas representa de 50 a 70 % do peso dos machos. O cultivo monossexual é uma técnica que consiste em cultivar apenas indivíduos machos para engorda, apresentando vantagens como: impedir a reprodução nos tanques, crescimento mais homogêneo e cerca de 25% maior que o das fêmeas, maior rendimento de carcaça, além do controle da população (LIMA, 2008).   2.2  Produção de populações monossexuais masculinas   Em uma estimativa da produção de pescado no Brasil, no ano de 2007, concluiu-se que as tilápias são os peixes mais cultivados, representando cerca de 30% do total produzido. Devido à utilização das técnicas de manipulação de reversão e de seleção genética, houve uma mudança no conceito de tilapicultura, decorrente de resultados positivos que apontam a tilápia como um peixe com grande potencial de cultivo em todo o País. Para o controle da superpopulação, alguns métodos são empregados, como a sexagem por hibridação, poliploidia, ginogênese e androgênese, altas temperaturas e a reversão por meio de hormônios masculinizantes, tanto na ração como em banhos de imersão (ZANARDI et al. 2011). Nas criações comerciais, uma das principais vantagens obtidas pelo cultivo monossexo é quando um dos sexos apresenta, em relação ao outro, uma destacada superioridade na taxa de crescimento. Assim, dependendo da espécie, as técnicas de controle do sexo podem trazer benefícios como: supressão da reprodução, contenção de gastos energéticos com a atividade reprodutiva, uniformidade de tamanho na colheita, redução dos efeitos da maturação sexual na aparência e na qualidade da carne, bem como a diminuição dos riscos de impacto ambiental decorrente do escape de peixes para os sistemas naturais (BEARDMORE et al. 2001). Os métodos de reversão sexual utilizando-se hormônios andrógenos na dieta ou em banhos de imersão têm sido os mais utilizados e pesquisados, por mostrarem-se eficientes, de fácil utilização e economicamente viáveis. Porém, o uso de hormônios na reversão sexual tem estado sob crescente discussão, devido aos possíveis impactos sobre a saúde do peixe e do homem e sobre o ambiente. Esta prática é permitida nos EUA e proibida na Europa (EL-SAYED, 2006). O hormônio na ração é o método mais utilizado, podendo chegar a 98% de machos no lote, com a utilização de 60 mg de 17 α-  metiltestosterona (MT)/Kg de ração, por um período de 30 dias (ZANARDI et al. 2011). Guerrero (1975) destaca que a administração do hormônio 17 α- metiltestosterona é efetiva e prática para aplicação em larga escala no processo de reversão sexual e apresenta as seguintes vantagens: a) a reprodução das tilápias em tanques é minimizada ou eliminada; b) as fêmeas não são desprezadas, como no método de cultura monossexo de machos sexados; c) é obtida produção mais alta de peixes devido ao melhor crescimento dos machos; d) pode ser empregada uma alta densidade de estocagem no tratamento dos peixes durante a reversão; e) o método não é muito trabalhoso ou oneroso. Segundo Popma e Lovshin (1996), na reversão sexual, esteroides masculinos são administrados a larvas recém-eclodidas. Este manejo faz com que os tecidos, ainda indiferenciados, das gônadas de fêmeas (geneticamente fêmeas) desenvolvam-se em tecido testicular, produzindo indivíduos que crescem e funcionam reprodutivamente como machos. A administração do hormônio é feita via oral, através da alimentação. O processo deve ser iniciado antes que o tecido da gônada primitiva tenha se diferenciado em tecido ovariano, o que ocorre em 3 ou 4 semanas após a eclosão. O percentual de machos fenotípicos, após tratamento hormonal de reversão sexual, frequentemente fica acima de 95%, mas ocasionalmente podem ocorrer percentuais de 80 a 90%. As razões para essas eventuais reduções na taxa de reversão ainda não estão claramente entendidas, mas o tamanho e idade adequados para o início do tratamento, bem como crescimento muito acelerado, são causas prováveis. O crescimento rápido, resultado de uma combinação de alta temperatura e boa qualidade da ração, pode induzir a larva a passar velozmente pela estreita janela da suscetibilidade da reversão sexual (LEONHARDT, 1997). Leonhardt (1997) afirma ainda que o esteroide 17 α- metiltestosterona é eliminado logo após o término do tratamento, não sendo mais encontrado em peixes de 1 g, sugerindo não haver nenhum dano ao consumidor, já que o peixe é criado muitos meses sem esteroides antes do abate. Cavalcante et al. (2004) atestaram que, apesar da difusão da tecnologia da reversão do sexo em peixes, faltam meios eficazes na avaliação da qualidade desta reversão. Geralmente, a eficiência do processo de reversão é avaliada por meio da histologia das gônadas dos peixes (Paller e Guerrero III, 2001). Ou ainda, mais recentemente, pelo método do acetato-carmim, desenvolvido por Guerrero e Shelton (1974) e validado para a tilápia do Nilo por Wassermann e Afonso (2002) - que consiste em observar ao microscópio óptico as gônadas coradas com acetato carmim, observando a presença ou não de ovócitos.

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Materiais e Métodos

O experimento foi conduzido no Instituto Federal de Minas Gerais - Campus Bambuí, no Setor de Piscicultura, em Bambuí-MG, situada à latitude -20.031111º e longitude -46.008811º, com 725,9 m de altitude. O clima é classificado como Cwa (subtropical úmido). A temperatura média durante a realização do experimento foi de 17,3 entre os meses de maio a julho de 2013. O hormônio masculinizante 17 α- metiltestosterona foi fornecido por via oral, que é a forma comercial mais amplamente utilizada, veiculado juntamente com a ração. A ração triturada, utilizada para o processo de inversão foi composta de 45 a 50% de proteína bruta com granulometria inferior a 0,5 mm, de modo que os animais pudessem ingeri-la. Adicionou-se o hormônio sintético 17 α- metiltestosterona, responsável pela inversão sexual. As dosagens utilizadas foram de 45 mg do hormônio por quilo de ração (T1), 60 mg do hormônio por quilo de ração (T2) e 75 mg do hormônio por quilo de ração (T3). Para facilitar o preparo da ração masculinizante foi preparada solução-estoque dissolvendo-se um grama do hormônio em um litro de álcool etílico (não aromatizado), com concentração de 1 mg do hormônio por mL de álcool. A solução foi estocada em embalagem de vidro, coberta com folha de alumínio e mantida sob refrigeração, conforme metodologia descrita por Yasui et al. (2006). Para o preparo da ração, utilizou-se a alíquota da solução-estoque do hormônio correspondente ao tratamento, sendo de 45 mL para T1, 60 mL para T2 e 75 mL para T3, adicionada a meio litro de álcool etílico. Após a homogeneização da solução final, esta foi adicionada a um quilo de ração triturada. Realizada a mistura, a ração foi seca à sombra, em bandeja. Posteriormente à secagem, a ração foi armazenada em potes de plástico e mantida sob refrigeração. As pós-larvas utilizadas no experimento foram capturadas no setor de piscicultura do instituto com puçá (rede de coleta manual) de malha fina (1,6 mm) e submetidas a um separador de malha rígida de 2,5 a 3,0 mm para seleção por tamanho. Larvas de comprimento superior a 14 mm eram descartadas, já que o processo de diferenciação gonadal estava avançado. Os animais, à medida que eram coletados iam sendo transferidos para caixas de isopor contendo água do mesmo tanque de onde eram retirados, com sal adicionado na proporção de 0,03% para possibilitar o equilíbrio osmótico e o controle fúngico e bacteriano. Após esse procedimento, foi estimado o número de pós-larvas pelo método volumétrico, no qual eram colocadas em pequenos recipientes e contadas, relacionando-se o volume com o número de larvas. As pós-larvas foram estocadas nos viveiros de inversão em que estavam instalados hapas (local de contenção), numa densidade de 2.000-5.000 larvas/m³ de “hapas”, assumindo uma ocupação de até 50% da área do viveiro. Nesta fase, as pós-larvas foram estocadas numa quantidade aproximada de 4.000 unidades por hapa, onde permaneceram por 28 dias recebendo a ração com o hormônio masculinizante. Essa ração foi fornecida 6 vezes ao dia - às 7h, 9h, 11h, 13h, 15h e 17h durante os 7 dias da semana. A quantidade de ração fornecida ia se ajustando ao comprimento médio das pós-larvas (Tabela 1) e o diâmetro da partícula continha 0,5 mm. Após o período de fornecimento da ração com o hormônio 17 α- metiltestosterona, os alevinos foram contados e transferidos para os tanques de alvenaria. A segunda fase, para crescimento dos peixes, teve duração de 2 meses após a inversão.  Nessa fase, os peixes continuaram recebendo ração farelada, mas sem o hormônio, 6 vezes ao dia. A quantidade e a granulometria da ração fornecida foram ajustadas conforme o consumo e o crescimento dos animais. Nessa fase, utilizou-se um tanque de alvenaria para cada tratamento, sendo limpos sempre que necessário. A temperatura da água foi medida 2 vezes diariamente, sendo uma às 8h e a outra às 14h. Ao final do período de 3 meses, quando os alevinos atingiram tamanho suficiente para a identificação do sexo, foram colhidos exemplares de modo aleatório, com o auxílio de uma rede de arrasto, estando estes com um dia de jejum. Ao final do experimento, a quantidade de animais por tratamento foi reduzida, devido ao intenso processo de predação observado nos tanques, portanto, foram adquiridas amostras de 60 animais por tanque. Após a coleta, os animais foram pesados e sacrificados em solução de formol 10%. Para a conservação dos mesmos, eles foram transferidos para vasilhames plásticos com tampa, contendo solução de álcool etílico 70%, para posterior identificação do sexo. A identificação do sexo e a proporção de machos foram determinadas pela análise das estruturas das gônadas, utilizando-se a técnica do acetato-carmim descrita por Guerrero e Shelton (1974) e validada para alevinos de tilápia do Nilo por Wassermann e Afonso (2002). Para o preparo da solução de acetato-carmim, foi adicionado meio grama dessa substância a 100 mL de ácido acético 45%, fervendo-se a solução resultante por 5 minutos. Após o resfriamento da amostra à temperatura ambiente, a solução foi filtrada com o uso do filtro de papel e estocada em um recipiente de vidro (âmbar) (YASUI, 2006). As gônadas foram retiradas dos alevinos por meio da abertura da cavidade abdominal pelo ventre, com o auxílio de uma pinça, e colocadas em lâminas coradas com uma ou duas gotas de acetato-carmim, comprimidas levemente com uma lamínula e, posteriormente, examinadas ao microscópio óptico, sob objetiva 40x, em toda a sua extensão. Para a identificação dos sexos, utilizou-se o critério adotado por Makino (2005), conforme ilustrado na Figura 1. No macho ou fêmea invertida, a gônada é uniforme, de tecido conjuntivo denso. Na fêmea, a gônada possui ovários com ovócitos de núcleos corados. Nakamura et al. (1998), citados por Makino et al. (2009), afirmaram que, durante o processo de inversão sexual em peixes, a masculinização da papila urogenital pode acontecer antes da masculinização gonadal. Assim, um peixe pode parecer macho externamente e internamente apresentar ovários. Sendo assim, o método da análise histológica das gônadas torna-se mais eficaz para determinação da eficiência da inversão. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05).

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Resultados e Discussão

Pelos dados obtidos (Tabela2), observou-se que a eficiência da inversão sexual aumenta conforme a quantidade de hormônio masculinizante na ração, sendo que todas as porcentagens de inclusão do hormônio foram eficientes, acima de 95% de eficácia. Devido ao custo desse hormônio e pensando na viabilidade de produção em reduzir custo com produção obtendo bons índices, pode se utilizar a inclusão de 45 mg, devido ao resultado satisfatório apresentado pelo nível mínimo do hormônio. Segundo Popma & Lovshin (1996), o percentual de machos depois do tratamento hormonal ocasionalmente pode estar em torno de 80%, o que é considerado baixo. Porém, com as doses de hormônios utilizadas no experimento, foram observados valores altos das médias da taxa de inversão sexual. Mesmo assim, numericamente, percebeu-se tendência maior de inversão nos animais tratados com 75 mg do hormônio masculinizante, alcançando 100% de indivíduos machos. Segundo Moyle & Cech (1998), citado por Oliveira (2013), um dos fatores que mais afetam a sobrevivência dos peixes é a qualidade da água nos tanques de produção (temperatura, CO2, oxigênio dissolvido, amônia). Dentre as características que determinam a qualidade da água, a temperatura teve papel relevante no experimento, que se iniciou no período frio do ano, e está intimamente relacionada com o metabolismo dos animais. A amplitude térmica da temperatura máxima e mínima encontrada durante o período experimental nos horários de medição alcançou 20ºC (Tabela 3). A temperatura ambiente média durante a realização experimental, obtida pela estação metereológica do instituto foi de 17,3 ºC, abaixo da temperatura ideal para a espécie estudada. No entanto, apesar de observada alta taxa de mortalidade para o experimento devido aos fatores mencionados, o processo de inversão sexual não foi prejudicado. De acordo com Kubitza (2000), as tilápias, peixes tipicamente tropicais, apresentam conforto térmico entre 27,0 e 32,0 ºC. Abaixo ou acima desse intervalo, verifica-se redução do apetite, do consumo de alimento e, consequentemente, do crescimento. Abaixo de 18 ºC, o sistema imunológico das tilápias é suprimido. Para estes peixes, temperaturas entre 8,0 e 14,0 ºC são letais, considerando-se a espécie, a linhagem e as condições dos peixes e do ambiente. Segundo Graeff & Pruner (2006), a temperatura da água é um fator importante no cultivo de peixes, pois influencia diretamente a ingestão de alimentos, bem como a quantidade de alimento a ser fornecido e o horário de arraçoamento, nos diferentes sistemas de criação. Devido à intensa variação da temperatura no decorrer do experimento, tendendo principalmente para valores inferiores ao recomendado, notou-se baixo consumo de alimento pelos peixes, que limitou seu crescimento e desenvolvimento A desuniformidade de pesos médios dos peixes entre os tratamentos (Tabela 4) pode ser explicado, dentre vários fatores ambientais, pela temperatura média da água de cada tanque, pois o lote com a maior média de peso obteve maior temperatura da água e a menor média de peso foi referente ao tanque com a menor temperatura média da água. De acordo com Nogueira & Rodrigues (2007), aos 90 dias de idade os peixes apresentam aproximadamente 100 gramas, sendo observado no experimento valor inferior ao apresentado (média de 33,41 gramas). Além da baixa temperatura, outro fator que pode ter afetado o baixo desempenho dos animais está relacionado ao arraçoamento, pois foi observado que com o decorrer do tempo após alimentação que a ração que não era consumida pelos peixes ia sendo depositada no fundo dos tanques. Como a renovação de água nem sempre era suficiente para mantê-la limpa, a ração que ficava despercebida no fundo propiciava queda de oxigênio dissolvido e geração de amônia, que contribuiu para deterioração da qualidade da água e, consequentemente, para a alta mortalidade detectada no período experimental.

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Conclusões

Apesar da baixa temperatura ambiente observada e consequentemente a baixa temperatura da água nos tanques experimentais, os três níveis do hormônio estudados foram altamente eficazes em promover a inversão sexual em tilápias (eficiência acima de 95%). Porém, o desempenho dos animais foi prejudicado, ficando abaixo do encontrado para espécie aos 90 dias.

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Gráficos e Tabelas

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Referências

BEARDMORE, J. A.; MAIR, J. A.; LEWIS, R. I. Monosex male production in finfish as exemplified by tilapia: aplications, problems and prospects. Aquaculture, Amsterdam, v. 197, 283 – 301 p. 2001.   BORGES, A. M. Efeito da Temperatura da Água na Produção de Populações Monossexo de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) da Linhagem Chitralada. Dissertação (Mestrado em Ciências Agrárias). Universidade de Brasília (UNB). Brasília: DF, 2004.   CASTAGNOLLI, N. Piscicultura de água doce. Jaboticabal: FUNEP, 189 p. 1992.   CAVALCANTE, J. M. M.; FARIAS, J. O.; CAMPELLO, C. C. C.; CARVALHO, M. A. M.; GONDIM, J. M. Avaliação de método alternativo na determinação da proporção sexual de alevinos de tilápia por esmagamento gonadal em lâmina/lamínula em comparação ao método do acetato-carmim. In: IX Semana Universitária – XIII Encontro de Iniciação Científica. Fortaleza. Anais....Fortaleza; UECE, 2004. CD-ROM. 2004.   EL-SAYED, A. F. M. Tilapia culture. 1.ed. Cambridge, CABI Publishing. 277p. 2006.   GRAEFF, A.; PRUNER, E. N. Variáveis que podem interferir na sobrevivência e desenvolvimento da Tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) na região fria do Estado de Santa Catarina. Comunicación Científica, CIVA 2006 . EPAGRI, Estação Experimental de Caçador. Unidade de Piscicultura. Caçador: SC, 70-79p. 2006.   GUERRERO, R. D.; SHELTON, W. L. An acetate – carmim squash technique for sexing juvenile fishes. The Progressive Fish – Culturist, Alabama, v. 36, 56p. 1974.   KUBITZA, F. Tilápia: tecnologia e planejamento na produção comercial. Jundiaí: Kubitza, 2000.   KUBITZA, F. Nutrição e alimentação dos peixes. Piracicaba: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 74p. 1997.   LEONHARDT J. H. Efeito da reversão sexual em tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1757). Pós- Graduação em Aquicultura (Tese de Doutorado), Campus de Jaboticabal – UNESP Jaboticabal – SP 1997.   LIMA F. P. C. Reversão Sexual em Tilápias (Oreochromis niloticus). Medicina Veterinaria (Notas de Aula). Universidade de Formiga- UNIFOR- MG, 2008.     LUND, V. X.; FIGUEIRA, M. L. O. A. Criação de tilápias. São Paulo: Livraria Nobel,

1989. 63p.

  MADRID, R.M. Análise de viabilidade econômica e financeira de projetos de aquicultura. Panorama da Aquicultura, v.8, n.49, p. 20-23,1998.   MAKINO, L. C. Validação dos métodos de identificação do sexo em tilápias do nilo (oreochromis niloticus, linnaeus, 1757), revertidas com rações contendo diferentes granulometrias e de diferentes idades. Dissertação (Mestrado em Aquicultura). Universidade Estadual Paulista – UNESP, Jaboticabal: SP (Brasil), 2005.   MAKINO, L. C.; NAKAGHI, L. S. O.; PAES, M. C. F.; MALHEIROS, E. B. et al. Efetividade de métodos de identificação sexual em tilápias-do-Nilo (Oreochromis niloticus) revertidas sexualmente com hormônios em ração com diferentes granulometrias. Universidade Estadual Paulista – UNESP, Jaboticabal: SP (Brasil), 2009.   NOGUEIRA, A. C.; RODRIGUES, T. Criação de tilápias em tanques-rede. Salvador: Sebrae Bahia. 23 p. 2007.   OLIVEIRA, A. M. B. M. S De; CYRINO J. E. P. Estresse dos peixes em piscicultura intensiva, 2013. Disponível em: <http://blog.projetopacu.com.br/wp-content/uploads/Artigo-estresse-dos-peixes-em-piscicultura-intensiva.pdf>, acessado dia 20/05/2013.   PHELPS, R. P.; POPMA, T. J. Sex reversal of tilapia. In: COSTA-PIERCE, B. A.; RAKOCY, J. E. Tilapia aquaculture in the americas. Louisiana: The World Aquaculture Society, v. 2, p. 34-59, 2000.   POPMA, T. J.; LOVSHIN, L. Wordwide Prospects for Commercial Production Of Tilápia. Internacional Center for Aquaculture and Aquatic Environments. Auburn: Auburn University, Alabama. Research And Development. Series n. 41, 23 p. 1996.   PROENÇA, C. E. M. de; BITTENCOURT, P. R. L. Manual de Piscicultura Tropical. Brasília: IBAMA, 196 p. 1994.   TACHIBANA, L. Desempenho inicial e digestibilidade aparente de nutrientes de diferentes linhagens de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). São Paulo, 2002.   ZANARDI M. F.; DIAS- KOBERSTEIN T, C, R.; SANTOS M. A. dos.; MALHEIRO E. B. Desempenho produtivo e reversão sexual em tilápias em dois métodos hormonal Doutorado do Centro de Aquicultura- CAUNESP. UNESP, Jaboticabal- SP. 2011.   YASUI, G. S.; SANTOS, L. C.; FILHO, O. P. R.; SHIMODA, E.; ARIASRODRIGUEZ, L. Cultivo monossexual de tilapias: importância e obtenção por sexagem e inversão sexual. Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, n. 51, p. 3761, 2006.   WASSERMANN, G. J.; AFONSO, L. O. B. Validação da técnica do acetato-carmim para avaliar o sexo de alevinos de tilápia nilótica (Oreochromis niloticus). Ciência Rural, Santa Maria, v. 32, n. 1, p. 133-139, 2002.