Expressão relativa do gene ANT em frangos de corte suplementados com glicerina
Bruna Tássia dos Santos Pantoja1, Adriana Costa Oliveira2, Fabiana Cristina Belchior de Sousa3, Renan de Sousa Araújo4, Katiene Régia Silva Sousa5, Leilane Rocha Barros Dourado6, Daniel Biagiotti7, Geraldo Fabio Viana Bayão8
1 - Universidade Federal do Maranhão
2 - Universidade Federal do Maranhão
3 - Universidade Federal do Piauí
4 - Universidade Federal do Piauí
5 - Universidade Federal do Maranhão
6 - Universidade Federal do Piauí
7 - Universidade Federal do Piauí
8 - Universidade Federal do Maranhão
2 - Universidade Federal do Maranhão
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6 - Universidade Federal do Piauí
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8 - Universidade Federal do Maranhão
RESUMO -
Objetivou-se avaliar a expressão do mRNA do gene mitocondrial que está envolvido no metabolismo energético, Adenina nucleotídeo translocase (ANT), no fígado de frango de corte aos 42 dias de idade, suplementados com dietas contendo 0%, 6% e 12% de glicerina. As amostras de fígado foram coletadas de seis animais de cada um dos três tratamentos de um delineamento inteiramente casualizado. A expressão relativa do gene ANT foi feita por RT-qPCR usando o sistema de fluorescência SYBR Green e o gene β-actina como controle endógeno. As análises foram feitas pelo proc MIXED do software SAS. Os diferentes níveis de glicerina não influenciaram na expressão do gene ANT no fígado de frangos de corte aos 42 dias de idade, entretanto, são necessários mais estudos relacionados a mudanças fisiológicas em nível molecular em função da alimentação para auxiliar nas explicações das diferenças individuais encontradas.
Palavras-chave: fosforilação oxidativa, gene mitocondrial, nutrigenômica, RT-qPCR
Relative expression of ANT gene in broilers supplemented with glycerin
ABSTRACT - The objective was to evaluate the mitochondrial mRNA gene expression that is involved in energy metabolism, Adenine nucleotide translocase (ANT), in broiler’s liver at 42 days old, supplemented diets containing 0%, 6% e 12% of glycerin. Liver samples were collected from six animals from each of the three treatments of a completely randomized design. The relative expression of the ANT gene was done by RT-qPCR using SYBR Green fluorescence system and the β-actin gene was used as endogenous control. Analyses were made by proc MIXED of SAS software. Different glycerin levels did not influence the expression of ANT gene in broiler´s liver at 42 days old; however, it is necessary more studies related physiological changes in molecular level in function to feed to helps in explanations of individual’s differences.Keywords: mitochondrial gene, nutrigenomics, oxidative phosphorylation, RT-qPCR
Introdução
A Nutrigenômica é a ciência que estuda como os componentes da dieta afetam a expressão dos genes e quais genes são induzidos ou reprimidos face a um determinado nutriente (Kussmann et al., 2006). A glicerina, proveniente da produção de biodiesel, tem sido apresentada como alimento alternativo na alimentação de frangos, já que os gastos com alimentação representam boa parte dos custos de produção (Silva et al., 2016). A inclusão de glicerol, em codornas e frangos de corte, está relacionada como fonte de energia e pode influenciar a expressão do gene mitocondrial Adenina nucleotídeo translocase (ANT), que está relacionado à eficiência na síntese de ATP e ao estresse oxidativo. E a eficiência na conversão de alimentos em massa corporal está relacionada com vários fatores, entre eles, a eficiência na produção de energia pelas mitocôndrias (Gasparino et al., 2015). Portanto, objetivou-se comparar a expressão gênica do ANT no fígado de frangos de corte aos 42 dias de idade que foram suplementados com dietas contendo diferentes níveis de glicerina.Revisão Bibliográfica
A nutrigenômica estuda como os nutrientes interagem com o genoma e como as mudanças produzidas por esta interação afetam as características de interesse na produção animal. Com o auxílio de ferramentas genômicas, pesquisas com a expressão gênica na área de nutrição permitem maior entendimento de como os nutrientes presentes e disponibilizados pela dieta influenciam na fisiologia e, consequentemente, no desempenho do animal (Muller; Kersten et al., 2003). Ainda na nutrição animal, pesquisadores buscam por alimentos alternativos que possam viabilizar a diminuição nos custos da produção e, a utilização do subproduto oriundo da indústria do biodiesel, o glicerol, pode ser utilizado parcialmente como substituto do milho, pois é uma fonte de energia, uma vez que possui valor energético semelhante (Silva et al., 2013). A associação entre eficiência na produção de energia da mitocôndria e a eficiência alimentar do animal tem sido alvo de várias pesquisas (Gasparino et al., 2012, Gasparino et al., 2015, Silva et al., 2013, Silva et al., 2016); pois mudanças na expressão dos genes relacionados a cadeia transportadora de elétrons pode afetar a utilização de nutrientes e metabolismo basal, além de alterar o gasto energético e, consequentemente, influenciar no incremento calórico. Em animais que são mais eficientes em converter o alimento em peso corporal é observado alterações na expressão desses genes, o que pode influenciar no consumo de energia pelo corpo (Bottje; Carstens, 2009). O ANT é uma proteína importante que está envolvida no processo de síntese energética, e é responsável pelo deslocamento do ADP do citosol para a mitocôndria e pelo deslocamento do ATP através da membrana interna mitocondrial (Gasparino et al., 2012). Bottje & Carstens (2009) mostraram a relação entre a conversão alimentar e a cadeia respiratória, e Silva et al. (2013) observaram que a inclusão de 12% de glicerol na dieta de codornas aumentava a expressão do gene ANT, porém diminuía o ganho de peso do animal e aumentava a conversão alimentar.Materiais e Métodos
O experimento foi conduzido no Setor de Avicultura do Colégio Técnico Agrícola da Universidade Federal do Piauí, Campus Profª Cinobelina Elvas (Bom Jesus- PI). O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com três tratamentos (0, 6 e 12% de glicerina) e seis repetições de cinco aves cada. Foi utilizada ração formulada à base de milho e farelo de soja (referência), conforme recomendações nutricionais de Rostagno et al. (2005) e as demais obtidas pela inclusão da glicerina à referência. Cinco aves de cada tratamento foram abatidas por deslocamento cervical ao final dos 42 dias e coletaram-se amostras de fígado, que foram armazenadas em microtubos de 2mL contendo RNA Holder® (BioAgency Biotecnologia, Brasil), e posteriormente, armazenadas em freezer -80ºC até a extração do RNA. No laboratório de Biotecnologia Animal (Labtec) (UFV-MG), o RNA total foi extraído de 100 mg do fígado com uso do reagente Trizol® (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) de acordo com as normas do fabricante. Para confecção do cDNA, foi utilizado o kit ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA Synthesis (New England, BioLabs Inc., Ipswich, Massachusetts, USA), de acordo com as normas do fabricante. Para as reações de PCR em tempo real, foi utilizado o sistema de detecção de fluorescência GoTaq®qPCR Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Os primers utilizados nas reações para a amplificação da ANT e do controle endógeno β-actina foram desenhados por meio do programa Primer Quest (www.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest) fornecido pela Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA) a partir de sequências de nucleotídeos obtidas do banco de dados do GeneBank (htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os resultados obtidos em Ct foram analisados com proc MIXED do software SAS (versão 9.0), as médias dos contrastes foram comparadas pelo teste t de Student e a expressão relativa está apresentada em 2-ΔCt (Livak; Schimittgen, 2001).Resultados e Discussão
Não houve diferença na expressão gênica do ANT no fígado das aves ao se comparar os diferentes níveis de glicerina (Figura 1). Entretanto, Silva et al (2013) ao estudarem os diferentes níveis de glicerol (0%, 8% e 12%) em codornas de corte, observaram que os animais que foram suplementados com os níveis 0% e 8% tiveram a expressão do ANT inalterada; o que foi observado também neste trabalho; porém, quando eles avaliaram a inclusão de 12% de glicerol houve aumento significativo na expressão em relação aos outros tratamentos, enquanto nós não encontramos diferença. A diferença de resultados pode ser devido ao uso da glicerina, que é um composto com menor concentração de glicerol, uma vez que Silva et al. (2013) utilizaram o glicerol, que é um composto puro; além disso, as espécies estudadas foram diferentes podendo haver respostas diferentes quanto à alimentação. Mas também, durante o processo de fosforilação oxidativa, podem existir falhas na condução de prótons do espaço intermembranoso para a matriz mitocondrial (Brand et al., 1995) devido ao desacoplamento no transporte de prótons causados por proteínas específicas que funcionam como desacopladores de membrana, como o gene ANT, podendo causar ineficiência mitocondrial. Kemp et al. (2003) afirmaram que a menor expressão desse gene pode ocorrer devido a menor eficiência celular ou maior dano oxidativo devido à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS).Conclusões
A inclusão de diferentes níveis de glicerina (0%, 6% e 12%) na dieta de frangos de corte aos 42 dias de idade não altera a expressão do mRNA do gene ANT no fígado.Gráficos e Tabelas
