IDENTIFICAÇÃO DO GENE MITOCONDRIAL CITOCROMO B DA ESPÉCIE DE JUNDIÁ AMAZÔNICO (Leiarius marmoratus)

IDENTIFICATION OF CYTOCHROME B MITOCHONDRIAL GENE ON AMAZONIC JUNDIA (Leiarius marmoratus)

ABSTRACT - The objective of the study was to identify the Cytochrome b mitochondrial genic region on Leiarius marmoratus. The assembly by reference was done with Bowtie2 program, using as reference the Cytochrome b mitochondrial gene of Leiarius pictus. To assemble the Cyt B gene, was used the reference sequence of Leiarius pictus, with the amount of 1223 pb, where from a number of 648977 reads from the library of Leiarius marmoratus, 43 reads were aligned to the reference fragment. Four polymorphism sites were identified between species. The data obtained will be used as a basis for future works and studies, searching for genetic improvement and conservation of the Leiarius marmoratus population.

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Introdução

A genética da conservação reúne os aspectos das genéticas moleculares, populacionais e quantitativa que nos ajuda a entender os motivos e as implicações das extinções de populações e a encontrar estratégias para a conservação da diversidade genética no futuro. A diversidade genética entre populações pode ser medida em termos da variação na aparência física ou no desempenho medido, da variação entre genótipos quanto a um grupo de locus, ou variação na sequência de DNA em um ou mais loci, mas a mesma pode ser perdida em consequência de seleção artificial e/ou do declínio no tamanho da população, por causas naturais ou humanas, (NICHOLAS, 2010).

Os marcadores moleculares baseados em DNA mitocondrial (mtDNA) possuem apenas herança materna, pôr à herança materna estar altamente conservada em muitos dos genes localizados no genoma mitocondrial, estes marcadores, muitas vezes podem ser usados para resolver as relações que medem períodos de tempo muito longos e são relevantes quando se considera questões de filogenia e importância taxonômica.

O Citocromo B (CytB) são sequências nucleotídicas do DNA mitocondrial importantes para a identificação de espécies, sendo assim esse trabalho objetivou identificar a região genica CytB da espécie Leiarius marmoratus, revelando a variabilidade existente no indivíduo, e consequentemente, na espécie.

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Revisão Bibliográfica

O Jundiá Amazônico (Leiarius marmoratus), é uma espécie de peixe nativo siluriforme da família Primelodidae, ocorre nas Bacias dos rios Amazonas e Orinoco, habita os leitos de rios e poços profundos, realizando migrações em seu período reprodutivo. Sua alimentação é onívora, ou seja, alimenta-se de insetos, peixes e material vegetal. É um peixe de grande valor econômico por apresentar várias características zootécnicas favoráveis para sua criação, dentre elas está à boa aceitação de alimentos e baixos índices de canibalismo durante a fase larval, mas tem sido uma espécie muito explorada comercialmente e utilizada na produção de linhagens híbridas. (MIRA LÓPEZ, 2014).

A diversidade biológica é fundamental para manutenção das espécies no que concerne à sua habilidade de adaptação e resposta às frequentes mudanças ambientais (BARKER e TINGEY, 1992), pois a perda da biodiversidade compromete o funcionamento dos ecossistemas, e a conservação de tais ecossistemas é de vital importância para vários setores econômicos em muitos países. O uso de marcadores baseados no DNA permite uma avaliação das relações filogenéticas entre espécies, gêneros e famílias, bem como entre populações. A vantagem é que as diferenças encontradas nas sequências de DNA não são modificadas pela ação do ambiente, como nos marcadores morfológicos ou mesmo nos marcadores proteicos (aloenzimas e isoenzimas), pois são fixadas no momento da fertilização. No desenvolvimento de marcadores moleculares, procura-se escolher regiões não-codificadoras de proteínas e, assim, tais regiões são consideradas neutras em relação aos potenciais efeitos da seleção natural. Desta forma, ao se medir a diferença genética entre duas regiões homólogas de DNA entre dois indivíduos, busca-se estimar quantitativamente o tempo em que estes dois indivíduos compartilhavam um ancestral em comum. Ao se avaliarem as diferenças genéticas com marcadores neutros, trata-se da estimativa indireta da variabilidade genética subjacente em genes envolvidos nos processos de adaptabilidade e evolução de uma população (NGUYEN et al., 2006).

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Materiais e Métodos

A biblioteca de DNA, da espécie Leiarius marmoratus foi obtida a partir de um sequenciador GAIIx (Illumina, USA) no modo paired-end, para a obtenção de sequências com 150 pares de bases (pb).

A qualidade de cada read foi analisada com o programa FastQC (PATEL e JAIN, 2012). Após a análise de qualidade foi realizada a remoção dos adaptadores e a remoção de read de baixa qualidade com o programa Trimmomatic (BOLGER et al., 2014). As sequências das extremidades dos reads foram removidas quando as médias de qualidade fossem inferiores a Phread 15 em intervalos de quatro bases. Também foram removidos os reads com comprimentos menores que 32pb. Para a verificação da eficiência da filtragem foi utilizado novamente o programa FastQC.

A montagem por referência foi realizado com o programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012) sendo utilizado como referência o gene mitocondrial Citocromo B (GenBank: DQ486764.1) com comprimento de 1223 bp da espécie Leiarius pictus.

O arquivo no formato SAM, gerado na montagem, foi transformado em formato BAM com o programa Samtoll (LI et al., 2009) e posteriormente a reads montadas contra a referência foram visualizadas com o programa Tablet (MILNE et al., 2013).

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Resultados e Discussão

O sequênciamento gerou um total 672095 reads, após utilizou-se o programa trimmomect para corrigir alguns desvios, onde permaneceram um total de 648977 reads com um tamanho de 36 à 151pb, onde todas as sequências obtiveram Phread acima de 23, tanto para forward e reverse. O algoritmo de nomeação de base mais conhecido e mais utilizado é o Phread, onde uma abordagem frequentemente utilizada por pesquisadores que procuram bases mal interpretadas em sequências de DNA é a escolha de um valor de qualidade mínimo baseado na intuição, considerando a significância do valor de qualidade Phread. Segundo PROSDOCIMI et al. (2004), Phread 20 é o mais amplamente utilizado, isso significa que uma base tem uma chance em uma centena de ser mal nomeada.

Para a montagem do gene CytB a sequência de referência de Leiarius pictus, com um total de 1223pb, foi utilizada, onde de um total 648977 reads, da biblioteca de Leiarius marmoratus, 43 reads se alinharam ao fragmento de referência. Foram identificados quatro sítios de polimorfismo entre as espécies Leiarius marmoratus e Leiarius pictus, como pode ser observado na figura 1 e tabela 1. Segundo SILVA et al. (2012), nas últimas décadas as técnicas de biologia molecular vêm ganhando espaço nos estudos de identificação molecular e conforme CHUEIRE et al. (2003) com os seus últimos avanços é possível comparar sequências de nucleotídeos do DNA, principalmente em regiões codificadoras de genes específicos, considerada conservada entre as espécies em estudo, podendo usar esta informação nos estudos de identificação de espécies.

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Conclusões

A partir do sequenciamento nova geração foi identificado o gene mitocondrial CytB da espécie Leiarius marmoratus a partir da espécie Leiarius pictus. Os dados obtidos servirão de base para trabalhos e estudos futuros, buscando o melhoramento genético e conservação populacional da espécie Leiarius marmoratus.

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Gráficos e Tabelas

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Referências

BARKER, J.R.; TINGEY, D.T. Air pollution effects on biodiversity. Van Nostrand Reinhold, New York. 1992.

BOLGER, A.M.; LOHSE, M.; USADEL, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, n. 170, v. 1, p. 1-7, 2014.

CHUEIRE, L.M.O.; BANGEL, E.V.; MOSTASSO, F.L.; CAMPO, R.J.; PEDROSA, F.O.; HUNGRIA, M. Classificação taxonômica das estirpes de rizóbio recomendadas para as culturas da soja e do feijoeiro baseada no sequenciamento do gene 16S rRNA. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 1027, p. 833–840, 2003.

LANGMEAD, B.; SALZBERG, S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. n. 9, v.4, p. 357-359, 2012.

LI, H.; HANDSAKER, B.; WYSOKER, A.; FENNELL, T.; RUAN, J.; HOMER, N.; MARTH, G.; ABECASIS, G.; DURBIN, R. 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics, v. 25, n. 16, p. 2078-2079, 2009.

MILNE, I; STEPHEN, G.; BAYER, M.; COCK, P.J.A.; PRITCHARD, L.; CARDLE, L.; SHAW, P.D.; MARSHALL, D. Using Tablet for visual exploration of second-generation sequencing data. Briefings in Bioinformatics, n. 14, v.2, p. 193-202, 2013.

MIRA LÓPEZ, T.M. Reprodução induzida e desenvolvimento inicial do Jundiá Leiarius marmoratus (PISCES: SILURIDAE). 50 f. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências de Botucatu, 2014.

NGUYEN, T.T.T.; HURWOOD, D.; MATHER, P.; NA-NAKORN, U.; KAMONRAT, W.; BARTLEY, D. Manual on applications of molecular tools in aquaculture and inland fisheries management: part 1 - conceptual basis of population genetic approaches. Bangkok, Tailandia. 2006.

NICHOLAS, F.W. Genética de conservação. p.307-311. Em: Introdução à genética veterinária. 3a ed. Editora Artmed S.A. Porto Alegre, RS, 2010.

PATEL, R.K.; JAIN, M. NGS QC Toolkit: A Toolkit for Quality Control of Next Generation Sequencing Data. PLOS One, v.7, n. 2, 2012.

PROSDOCIMI, F.; PEIXOTO, F.C.; ORTEGA, J.M. Evaluation of window cohabitation of DNA sequencing errors and lowest PHRED quality values. Genetics and Molecular Research, v.3, n.4, p. 483-492, 2004.

SILVA, S.A.; KAVALCO, K.F.; PAZZA, R. Uso do sequenciamento de genes mitocondriais na identificação de files de salmão. Evolução e Conservação da Biodiversidade, v. 3, n.2, p. 64–67, 2012.