Polimorfismo do gene Citocromo b na espécie Rhamdia quelen

Polymorphism of the Cytochrome b gene in the Rhamdia quelen species

ABSTRACT - The Rhamdia quelen, known as Jundiá, has aroused great interest of the fish farmers of the south region for its resistance to handling, subtlety, accelerated growth, even in winter. Owing to overfishing, dam construction, pollution and other factors, the species has suffered a drastic decrease. Therewith, a way to protect jundiá is using and studying conservation and genetic variability, accessing secure information through molecular genetic study. This work sought to identify polymorphism in the mitochondrial cytochrome B gene of Rhamdia quelen revealing its characteristics. It was used 105 reads aligned to 883 base pairs of the reference gene, revealing 21 sites of differentiation. From the next generation sequencing was characterized mitochondrial cytochrome b gene of the species Rhamdia quelen, being of great relevance for future work based conservation and genetic enhancement.

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Introdução

O Jundiá (Rhamdia quelen), é um bagre onívoro, de ampla distribuição geográfica, tendo sua ocorrência sido registrada desde a região central da Argentina até o sul do México (SILFVERGRIP, 1996). Essa espécie tem despertado grande interesse nos piscicultores da Região Sul, pela sua resistência ao manejo, docilidade, crescimento acelerado, inclusive no inverno (CARNEIRO et al., 2002; FRACALOSSI et al., 2002). O uso de técnicas moleculares vem sendo crescentemente empregado em análises genéticas populacionais aumentando o conhecimento sobre os recursos genéticos existentes, além de sua distribuição geográfica levando em consideração os componentes históricos e/ou filogenéticos da estrutura populacional, sendo assim, ferramentas geradoras de informações importantes para a conservação desses recursos de diferentes espécies (FRANKHAN et.al.2008). Com isso o gene citocromo b é considerado um excelente marcador usado como ferramenta em filogenias moleculares e é provavelmente o gene mitocondrial mais conhecido em relação à estrutura e função de seu produto protéico (ESPOSTI et al., 1993). O objetivo do trabalho visa identificar o polimorfismo do gene citocromo B da espécie Rhamdia quelen, revelando a variabilidade existente no individuo, e consequentemente, na espécie.

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Revisão Bibliográfica

Rhamdia quelen é uma espécie de peixe amplamente distribuída na América do Sul e Central, ao leste dos Andes e entre a Venezuela e o Norte da Argentina (SILFVERGRIP, 1996). No Brasil ele apresenta potencial viável para piscicultura, tendo alto valor de mercado, boa eficiência alimentar e, sobretudo, por apresentar carne saborosa, sem espinhos instramusculares. O Jundiá têm sofrido acentuada redução de suas populações devido à construção de barragens, destruição de hábitats, pesca predatória, introdução de peixes exóticos e a poluição (AGOSTINHO et.al., 1999).

Uma das maneiras de contribuir cientificamente para que essa espécie não seja extinta é a utilização da conservação e variabilidade genética. É possível acessar informações e assegurar o conhecimento sobre populações naturais através do estudo genético molecular (FRANKHGAN et.al.2008)

Segundo SILVA et al. (2012), nas últimas décadas as técnicas de biologia molecular vêm ganhando espaço nos estudos de identificação molecular e, com os seus últimos avanços é possível comparar sequências de nucleotídeos do DNA, principalmente em regiões codificadoras de genes específicos, considerada conservada entre as espécies em estudo (CHUEIRE et al., 2003), podendo usar esta informação nos estudos de identificação de espécies.

O citocromo b, sendo parte do DNA mitocondrial, é a subunidade catalítica central da ubiquinol citocromo c reductase, enzima que está presente na cadeia respiratória da mitocôndria e na cadeia respiratória do ciclo foto-redox de muitas bactérias (MEYER, 1994), todos os organismos eucariotos necessitam desta classe de enzima redox, e consequentemente do citocromo b para a conversão de energia (ORREGO, 2012). Seu é justificado pela presença de regiões conservadas e variáveis, que contem sinais que podem ser utilizados em análises filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos, sendo um excelente marcador molecular, utilizado como ferramenta em filogenias moleculares (ORREGO, 2012).

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Materiais e Métodos

A biblioteca de DNA, da espécie Rhamdia quelen foi obtida a partir de um sequenciador Illumina no modo paired-end, para a obtenção de sequências com 100 pares de bases (pb).

A qualidade de cada read foi analisada com o programa FastQC (PATEL e JAIN, 2012). Após a análise de qualidade foi realizada a remoção dos adaptadores e a remoção de read de baixa qualidade com o programa Trimmomatic (BOLGER et al., 2014). As sequências das extremidades dos reads foram removidas quando as médias de qualidade fossem inferiores a Phread 15 em intervalos de quatro bases. Também foram removidos os reads com comprimentos menores que 32pb. Para a verificação da eficiência da filtragem foi utilizado novamente o programa FastQC.

A montagem por referência foi realizado com o programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012) sendo utilizado como referência o gene mitocondrial CYTB da espécie Rhamdia Quelen (GenBank: KR424001.1 ) com comprimento de 838pb.

O arquivo no formato SAM, gerado na montagem, foi transformado em formato BAM com o programa Samtoll (LI et al., 2009) e posteriormente as reads montadas contra a referência foram visualizadas com o programa Tablet (MILNE et al., 2013).

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Resultados e Discussão

O sequenciamento do DNA resultou em aproximadamente 5000000 reads, sendo estes de 50 a 100pb, subdivididos em dois arquivos paired-end. Subsequentemente fez-se a filtragem através do programa Trimmomatic mantendo-se 4930328 reads e sendo removidos 69.672 reads. As bases que restaram apresentam-se de boa qualidade, com valores de Phred acima de 24. Segundo Del Fabbro et al. (2013), ocorre o aumento das taxas de alinhamento dos reads a um genoma de referência, mesmo com a diminuição do volume de sequências após a filtragem.

Os totais de 105 reads alinharam a 838 pares de base do gene de referência CYTB de Rhamdia quelen) (figura 1), revelando 21 sítios de diferenciação entre os individuos (tabela 1). Segundo ORREGO (2012), todos os organismos eucariontes utilizam o CYTB para a conversão de energia, apresentando regiões variáveis e conservadas, utilizadas em análises filogenéticas com diferentes níveis taxonômicos.

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Conclusões

A partir do sequenciamento de nova geração identificou-se e caracterizou-se o polimorfismo do gene mitocondrial citocromo b da espécie Rhamdia quelen. É de grande relevância caracterizar regiões mitocondriais para base de trabalhos futuros de conservação e melhoramento genética.

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Gráficos e Tabelas

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Referências

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