Sensibilidade de cepas Staphylococcus aureus resistentes a beta-lactâmicos ao óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf
SAMUEL FERREIRA GONÇALVES1, YHAGO PATRYCKY ANTUNES SOUZA ASSIS2, CINTYA NEVES DE SOUZA3, KEICY SANDY SILVESTRE DE SOUZA4, PAULA KAROLINE SOARES FARIAS5, LIVIA MARA VITORINO DA SILVA6, ALCINEI MISTICO AZEVEDO7, ALESSANDRA REJANE ERICSSON DE OLIVEIRA XAVIER8
1 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
2 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
3 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
4 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
5 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
6 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
7 - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
8 - UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS
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RESUMO -
A pecuária leiteira atualmente é um dos setores que apresentam crescimento contínuo gerando alta rentabilidade ao país, porém hoje a mesma se encontra com dificuldades, uma vez que doenças podem acometer o rebanho tais como a mastite. A mastite se caracteriza pela inflamação da glândula mamária trazendo consigo a queda da produção do animal, além de a aplicação sucessiva de antibióticos podem ser um dos favores a causar multiresistência e não conseguindo sanar a doença. Atualmente estuda-se a utilização de óleos essenciais, como o Cymbopogon citratus, sendo isto como solução alternativa para o combate de microrganismos multirresistentes, utilizou-se quatorze cepas de Staphylococcus aureus frente ao teste de disco-difusão com concentrações diferentes do óleo, sendo estas concentrações 0μl, 30μl, 60μl, 120μl e 240 μl. Staphylococcus aures resistentes a beta-lactâmicos foram sensíveis aos óleo essencial de Cymbopgon citratus a partir da concentração de 30μl/ml. Observou-se que o óleo em estudo apresentou variação na capacidade de inibição de crescimento de cepas Staphylococcus aureus agrupadas em diferentes municípios, fazendas, grupos genéticos e perfis genotípicos.
Palavras-chave: Capim-limão, Multiressistência, Beta-lactâmicos
Sensitivity of Staphylococcus aureus strains resistant to beta-lactams to the essential oil of Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf
ABSTRACT - In present days, dairy farming is one of the sectors that shows continuous growth generating high profitability to the country, but it has difficulties, since the herd can be affected by diseases such as mastitis. Mastitis is characterized by the inflammation of the mammary gland causing the fall of animal’s production, and the successive application of antibiotics can be a important reason for multiresistance’s increase and most of times it can’t cure the disease. Studies have started to find alternative solutions for the control of multiresistant microorganisms and the use of essential oils have obtained recognition, highlighting Cymbopogon citratus. Fourteen Staphylococcus aureus strains were used in the disc diffusion test with different concentrations of the oil – 0μl, 30μl, 60μl, 120μl and 240μl. Staphylococcus aureus resistant to beta-lactams were sensitive to the essential oils of Cymbopgon citratus from the concentration of 30 μl / ml. It was observed that the oil in the study presented variation in the capacity of inhibition of growth of strains Staphylococcus aureus grouped in different municipalities, farms, genetic groups and genotypic profiles.Keywords: Lemon grass, Multiresistance, Beta-lactams
Introdução
A bovinocultura de leite é um dos setores mais produtivos no ramo agroindustrial do Brasil, colocando o país em destaque como produtor de leite, o setor a cada ano vem crescendo com continua expansão. O país hoje conta com a região sul do país como a maior produtora no geral representando cerca de 34,7% do total da produção no ano de 2014, porém o maior estado produtor de leite é representado por Minas Gerais com a produção total de 9,4 bilhões de litros de leite (IBGE, 2014). Atualmente a pecuária leiteira enfrenta sérios problemas relacionados a doenças, causado pela mastite. A etiologia da doença ocorre em diversas formas sendo a sua contração por infecção, traumática, alérgica, metabólica ou tóxica, sendo causadas principalmente por bactérias ou fungos. Os prejuízos desta doença caracterizam em perda de produção chegando a 70% da redução total dos quartos mamários e 8% da perca do leite total por alterações nos padrões físico-químicos do leite e resíduos com tratamentos para sanar o problema (PERES NETO, ZAPPA, 2011). Em razão da maioria das mastites serem causadas por bactérias, o uso indiscriminado de antibióticos por um longo período tem causado inúmeros problemas para o produtor, sendo uma das maiores dificuldades para controle a resistência bacteriana. Atualmente estuda-se a utilização de óleos essenciais como alternativas viáveis para o controle eficaz da doença, visto que é um método com menor agressividade e risco para o combate desses microrganismos, óleos essenciais tais como o Cymbopgon citratus (D.C.) Stapf, conhecido popularmente como capim limão, são estudados uma vez que propriedades efetivas frentes a microrganismos. Objetivou-se neste estudo verificar a sensibilidade de cepas de Staphylococcus aureus multirresistentes a beta-lactâmicos frente à utilização do óleo essencial de Cymbopgon citratus (D.C.) Stapf.Revisão Bibliográfica
As bactérias do gênero Staphylococcus são relacionadas pelas suas associações com doenças, uma das cepas de Staphylococcus, o Staphylococcus aureus é um dos maiores responsáveis pelas adversas patologias que acometem os animais. De 30 a 50 % das cepas de S. aureus e mais de 50% das bactérias do gênero Staphylococcus são resistentes a antimicrobianos adversos utilizados em tratamentos as patologias acometidas (Miyamoto, 2010). A resistência dos Staphylococcus spp. a diversos fármacos do grupo dos beta-lactâmicos se da principalmente pelo gene mecA que codifica uma proteína de baixa afinidade a estes fármacos sendo ela a PBP2a (SOARES et al., 2008). Na produção leiteira, a mastite é uma das causadoras principais de perdas econômicas, o S. aureus é um dos importantes agentes infecciosos, pois é produtor de enterotoxinas termotolerantes que inflamam as glândulas mamárias e contamina o leite que se consumido causa danos para saúde pública como intoxicação alimentar e alergia ( FACIOLI, 2010). Alguns aditivos alternativos aos antimicrobianos têm se mostrado favoráveis ao desenvolvimento animal, sendo benéficos a utilizações em tratamentos para patologias (Azevedo et al., 2017), muitos desses aditivos são os óleos essenciais, onde são encontrados em diversas partes das plantas, eles são originários do metabolismo secundário das mesmas sendo eles, ácidos, ésteres, compostos fenólicos, álcoois, terpenos e apresentam como característica principal alta diversidade química, volatabilidade e insolubilidade, sendo considerados substâncias ativas, e muitos estudos comprovam seus efeitos contra microrganismos pois possuem resultados comprovatórios como melhoradores de desempenho (PERAZZO, 2012; SOUZA et al. 2015). Quanto a composição dos óleos, elas possuem bastante diferença, pois podem variar de acordo com o clima, região, época de colheita dentre outros fatores (LEIMANN, 2001). O Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf é popularmente conhecido por capim-limão e possui como componente principal o citral que é um aldeído alifático composto pela mistura dos isômeros neral e geranial, o citral e confere ao óleo o aroma de limão, além do citral, o óleo de capim-limão possui outros componentes em menores quantidades sendo o mirceno, linalol, geraniol, limoneno (AZEVEDO, 2017), a planta é pertencente à família Poaceae e tem origem indiana sendo bastante difundida no Brasil, aonde desde culturas antigas vem sendo utilizada contra a gripe e diarreias, e como calmantes, analgésico e diurético.Materiais e Métodos
O óleo de Cymbopgon citratus (D.C.) Stapf, popularmente conhecido como Capim limão foi obtido através da colheita de plantas do horto medicinal do Instituto de Ciências Agrárias da UFMG, a técnica de extração para a obtenção do óleo por arraste a vapor a destilador piloto, (Linax®, modelo D20) Após a extração foi armazenado em frasco âmbar sob refrigeração (4-8°C). As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo a gás, Agilent Technologies (GC 7890A), acoplado a espectrômetro de massas (MS 5975C) dotado de coluna capilar DB-5 MS (Agilent Technologies, fase estacionária 5% fenil e 95% metilpolissiloxano, 30 m x 250 μm d.i. x 0,25 μm espessura do filme) e hélio (99,9999% de pureza) como gás de arraste, (1mL min-1). A amostra foi injetada (1 μL) no modo split 1:5 com injetor mantido a 220 ºC. A rampa de aquecimento da coluna iniciou a 60 ºC com taxa de 3 ºC min-1até 240 ºC, em seguida, com um gradiente de temperatura de 10°C min.–1 até 270 °C mantendo constante por 7 min. A interface com o espectrômetro de massas foi mantida a 240 °C e o mesmo operado por impacto de elétrons (70 eV ), no modo full scan, monitorando uma faixa de massa (40 a 550 m/z). O índice de retenção de todos os compostos foi calculado a partir do tempo de retenção de uma mistura de n-alcanos (C8- C32, Sigma USA) 20 ppm, split 1:100. Os dados gerados foram analisados utilizando o software MSD Chemstation juntamente com a biblioteca National Institute of Standards and Technology (NIST, 2002). Foram utilizadas 14 cepas identificadas como S. aureus provenientes de tetos de vacas com mastite subclínica provenientes de 12 fazendas em seis municípios da região norte de Minas Gerais. As cepas foram identificadas em etapa anterior por ensaio de PCR com o marcador genético femA foi utilizado para confirmação da espécie S. aureus e quanto ao perfil genético por RAPD-PCR (Idil & Bilkay, 2014). Estas foram classificadas genotipicamente como resistentes aos beta-lactâmicos penicilina, ampicilina e amoxicilina por teste de difusão em disco. Avaliou-se a sensibilidade das cepas ao óleo essencial de alecrim pimenta nas concentrações de 0μl, 30μl, 60μl, 120μl e 240 μl teste de disco-difusão em ágar descrito por CLSI (2015), frente a cepas em estudos padronizada em 0,5 da escala de MacFarland. Após a incubação em estufa de crescimento a 37º.C por um período de 24 horas realizou-se a leitura de cada halo de diâmetro em milímetros (mm). Foram realizadas a análise de variância (ANOVA) e de regressão pelo programa R versão 1.1.2 Para a análise de regressão escolheu-se o modelo linear, baseado na significância dos seus coeficientes.Resultados e Discussão
Os compostos majoritários presentes no óleo essencial em estudo foram β-citral (24,62%), β-mirceno (25,372%) e α-citral (31,899%) (Tabela 1), sendo estes compatíveis com descrito na literatura que descreve atividade antimicrobiana do óleo essencial de C. citratus (AJAYI, SADIMENKO, AFOLAYAN, 2016; AZEVEDO et al., 2017). A menor dose do óleo de capim limão (30μl/ml) se mostrou eficiente para promover formação de halo de inibição de crescimento, sendo os maiores halos observados com a concentração do óleo em 240μl/ml, estando estes resultados associados com a atividade antimicrobiana dose-dependentes dos óleos essenciais (Oliveira et al. 2014). Observou-se interação entre as diferentes concentrações dos óleos com tamanho dos halos de inibição entre os municípios, as fazendas, os grupos genéticos e perfis genotípicos. A partir dos resultados obtidos quando avalia-se as diferentes doses do óleo capim limão em relação aos municípios, pode-se inferir que a cada aumento em 01 µl do óleo de capim limão aumenta-se o diâmetro do halo de inibição dos municípios 1 e 3 em 5,11 mm e 4,32 mm respectivamente (Gráfico 1). Quando a análise foi feita pela interação das doses com as fazendas, verificou-se diferença entre o tamanho dos halos de inibição formados, sendo que a fazenda 6 foi a que apresentou maiores halos de inibição com o aumento das concentrações dos óleos (Gráfico 2) e esta fazenda está localizada no município 3, que também apresentou comportamento semelhante. Na avaliação das respostas de inibição de crescimento com diferentes concentrações, verifica-se que para o grupo genético S.aureus II a cada 01 µl do óleo de capim limão aumenta 8,45 mm o diâmetro do halo de inibição (Gráfico 3) e este grupo esteve presente na fazenda (Gráfico 2) e município (Gráfico 1) que apresentaram maior halo de inibição . O perfis genotípicos V, K e D apresentaram-se maiores halos de inibição em resposta à concentrações do óleo (Gráfico 4), comparando com os demais perfis. As cepas de Staphylococcus aureus classificadas em grupos e perfis genotípicos diferentes utilizadas neste trabalho apresentam multirresistência frente aos antimicrobianos do grupo beta-lactâmicos e também diferentes padrões de sensibilidade ao óleo essencial de capim limão. No entanto, ainda são necessárias pesquisas que avaliem a sensibilidade de cepas aos óleos baseando-se em capacidade de formar halos de inibição maiores ou menores. A resistência de bactérias à ação dos óleos essenciais ainda é objeto de estudo, e neste trabalho ficou evidente que grupos genéticos e perfis genotípicos diferentes de S. aureus apresentaram sensibilidade à ação do óleo em níveis diferentes. Pesquisas que estudam o mecanismo de ação dos óleos sobre as paredes de bactérias, bem como a atividade isolada ou em conjunto de diferentes componentes químicos dos óleos são relatadas em revisões de trabalhos descritas em importantes veículos de divulgação cientifica (SEOW et al., 2015, BASSOLÉ ). No entanto, na literatura consultada, não foram encontrados trabalhos que descrevessem mecanismos que explicassem a diferença de sensibilidade para cepas de um mesmo microrganismo frente a um mesmo óleo, como também não foram encontrados trabalhos que indicassem alguma relação entre a resistência de bactérias aos antimicrobianos e aos óleos essenciais.Conclusões
As cepas de Staphylococcus aureus resistentes a beta-lactâmicos foram sensíveis aos óleo essencial de Cymbopgon citratus (D.C.) Stapf a partir da concentração de 30μl/ml. Observou-se que o óleo em estudo apresentou variação na capacidade de inibição de crescimento de cepas Staphylococcus aureus agrupadas em diferentes municípios, fazendas, grupos genéticos e perfis genotípicos.Gráficos e Tabelas
